高效液相色譜法測(cè)定楊樹(shù)花口服液中水楊苷的含量

韓 立，班付國(guó)，周紅霞，邱天寶，劉素梅，張躍京

(河南省獸藥監(jiān)察所，鄭州450008)

楊樹(shù)花為楊柳科植物毛白楊(Populus tomentosa Carr.)、加拿大楊(Populus canadensis Moench.)或同屬數(shù)種植物的干燥雄花序［1－2］，主要藥用成分為酚苷類(lèi)化合物和黃酮類(lèi)化合物［3－4］。楊樹(shù)花口服液是楊樹(shù)花經(jīng)提取制成的合劑，收載于《中國(guó)獸藥典》二○一○年版二部，每1 mL相當(dāng)于原生藥1 g，多為水提醇沉法生產(chǎn)［5］，具有清熱解毒、化濕止瀉的功效，主治濕熱下痢，幼畜泄瀉。在畜牧業(yè)中，楊樹(shù)花及其制劑廣泛應(yīng)用于羊、豬、兔等動(dòng)物的腹瀉、細(xì)菌性痢疾等疾?。?－8］。目前質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有理化鑒別，不能有效控制藥品質(zhì)量。因此研究楊樹(shù)花化學(xué)成分，定量測(cè)定活性成分含量，對(duì)于控制楊樹(shù)花口服液質(zhì)量具有重要的意義。水楊苷具有解熱鎮(zhèn)痛和苦味健胃助消化作用，是楊樹(shù)花口服液清熱健胃的主要有效成分，可溶于水，易溶于沸水，也是楊樹(shù)花口服液的主要活性成分。因此定量檢測(cè)楊樹(shù)花口服液中的水楊苷含量，有助于完善產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，指導(dǎo)生產(chǎn)，提高藥品質(zhì)量［9］。本試驗(yàn)以水楊苷為參照物，測(cè)定了楊樹(shù)花口服液中水楊苷的量，對(duì)于控制藥品質(zhì)量和完善標(biāo)準(zhǔn)很有實(shí)用性。

1 儀器與試劑

Waters Acquity UPLC超高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)配置UPLC PDA光電二極管陣列檢測(cè)器/UPLC TUV紫外檢測(cè)器，Empower2色譜工作站采集數(shù)據(jù);METTLER TOLEDO XP205電子天平(十萬(wàn)分之一，瑞士METTLER TOLEDO公司);Milli－Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國(guó) Millipore公司)。

甲醇(色譜純)，中性氧化鋁(層析用)，純化水，水楊苷對(duì)照品(含量 98.0%，批號(hào) 4.530013.0001，ANPEL Scientific instrument Co.Ltd.)。楊樹(shù)花口服液樣品 3批(批號(hào)分別為 12101101，12101102，12101103，均由 1家獸藥生產(chǎn)企業(yè)提供)。

2 方法與結(jié)果

2.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用DAD檢測(cè)器在210 nm～400 nm對(duì)對(duì)照品進(jìn)行全掃描(圖1)，水楊苷分別在212、268、339、384 nm 波長(zhǎng)下有最大吸收，其中212 nm下吸收最大。分別比較4個(gè)波長(zhǎng)下樣品的色譜圖，發(fā)現(xiàn)水楊苷雖然在212 nm下吸收最大，但是雜質(zhì)吸收也較大，而在268 nm～270 nm下有比較大的吸收，且峰形較好，基線平穩(wěn)，分離度較高，所以將檢測(cè)波長(zhǎng)定為269 nm。

圖1 對(duì)照品光譜圖

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 流動(dòng)相為甲醇—水(10∶90);色譜柱:Waters XBridge C18，150 mm ×4.6 mm，5 μm;檢測(cè)波長(zhǎng) 269 nm;流速1.0 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;柱溫30 ℃。理論板數(shù)按水楊苷峰計(jì)算不低于3000，主峰的保留時(shí)間約為17.4 min(圖2－圖3)。

圖2 對(duì)照品色譜圖

圖3 楊樹(shù)花口服液色譜圖

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取水楊苷對(duì)照品53.26 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇制成每mL含0.5326 mg 的溶液，過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得水楊苷對(duì)照品溶液。

2.4 供試品溶液的制備 精密量取楊樹(shù)花口服液2 mL，過(guò)中性氧化鋁柱(內(nèi)徑為1.5 cm，5 g)，收集流出液，再用40 mL水洗脫，流出液和洗脫液合并至50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.5 線性關(guān)系考察 取水楊苷對(duì)照品適量，加水配制成含0.5 mg/mL的對(duì)照品溶液，分別稀釋成0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL，精密量取 10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。以水楊苷濃度為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，計(jì)算得回歸方程為:y＝1966x+15423，相關(guān)系數(shù) r=0.9995，結(jié)果表明水楊苷在 0.025～0.5 mg/mL 的濃度范圍內(nèi)，濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取水楊苷對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，記錄色譜圖，連續(xù)進(jìn)樣6次測(cè)定峰面積。結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.52%，表明系統(tǒng)精密度符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，分別在樣品處理后的 0、1、2、8、12 h 進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。結(jié)果表明，供試品溶液12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，RSD 為0.75%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為12101101的楊樹(shù)花口服液，精密量取2 mL，平行6份，依法進(jìn)行提取、測(cè)定，計(jì)算計(jì)算每份樣品中水楊苷的量，結(jié)果6份樣品中水楊苷的平均含量為3.3813 mg，RSD為0.76%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為12101101的楊樹(shù)花口服液，精密量取1 mL，平行6份，精密加入水楊苷對(duì)照品溶液5 mL(相當(dāng)于約2.6630 mg的水楊苷)，按照供試品溶液制備方法制成加樣供試品溶液，精密吸取加樣供試品溶液10 μL，按上述方法測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果表明，本法具有良好的回收率，見(jiàn)表1。

表1 水楊苷回收率試驗(yàn)

2.10 樣品的測(cè)定 取同一公司3批楊樹(shù)花口服液樣品，每批量取兩份，按供試品處理方法處理。取10 μL樣品溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，平行進(jìn)樣兩次，計(jì)算平均含量。各批次樣品的含量見(jiàn)表2。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論與小結(jié)

3.1 樣品的凈化 試驗(yàn)比較了樣品過(guò)中性氧化鋁柱和不過(guò)中性氧化鋁柱的效果。發(fā)現(xiàn)不過(guò)中性氧化鋁柱時(shí)，供試品溶液顏色較深，進(jìn)樣后雜質(zhì)峰較多，很難與目的峰分離。當(dāng)樣品過(guò)中性氧化鋁柱后，供試品溶液顏色變淺，雜質(zhì)峰明顯減少，樣品的含量幾乎沒(méi)有變化?？梢酝茢啵氐入s質(zhì)被中性氧化鋁吸附，但水楊苷基本都被洗脫下來(lái)。

3.2 樣品的含量 試驗(yàn)測(cè)定了同一公司3批樣品，水楊苷含量范圍為3.4 mg/mL左右。由于藥材來(lái)源不同，不同公司的生產(chǎn)工藝存在差異，楊樹(shù)花口服液中水楊苷含量相差可能較大。通過(guò)對(duì)自制的每1 mL相當(dāng)于原生藥1 g的楊樹(shù)花煎煮液進(jìn)行檢測(cè)，水楊苷含量達(dá)到10.8 mg/mL左右。參照《中國(guó)獸藥典》楊樹(shù)花口服液標(biāo)準(zhǔn)，有必要對(duì)楊樹(shù)花口服液中水楊苷的收率以及不同來(lái)源的楊樹(shù)花口服液中水楊苷含量進(jìn)行進(jìn)一步的測(cè)定和考察，以制定出合理的含量限度。

水楊苷是楊樹(shù)花口服液的主要成分和活性物質(zhì)，試驗(yàn)以水楊苷為定量目標(biāo)化合物，對(duì)于完善產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，提高藥品質(zhì)量具有現(xiàn)實(shí)意義。

［1］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典二○一○年版二部［S］.

［2］中國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一九七七年版一部［S］.

［3］梁延壽，張清芳.楊樹(shù)花化學(xué)成分的研究［J］.中藥通報(bào)，1988，13(1):41－42

［4］房春林.楊樹(shù)花及其復(fù)方制劑藥學(xué)與臨床應(yīng)用研究［D］.雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

［5］楊海涵，房春林，李 超，等.楊樹(shù)花提取工藝研究［J］.中國(guó)動(dòng)物保健，2011，13(4)21－23.

［6］張玉果，郝智松.治療畜禽下痢的中藥:楊樹(shù)花口服液［J］.北方牧業(yè)，2013，43(16):29

［7］張玉果，郝智松.楊樹(shù)花口服液在治療豬腸炎中的臨床應(yīng)用［J］.獸藥市場(chǎng)指南，2013，(8):37

［8］潘繼蘭.楊樹(shù)花防治羔羊痢疾［J］.當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)，2005，(4):22

［9］李來(lái)生，黃偉東，何 琦，等.高效液相色譜法測(cè)定柳樹(shù)皮提取物中的水楊甙［J］.色譜，2001，19(5)446 －447