黃芪多糖注射液中非法添加地塞米松磷酸鈉的檢查方法研究

顧明芬，陳小秋

(天津市獸藥飼料監(jiān)察所，天津300402)

地塞米松磷酸鈉是腎上腺皮質(zhì)激素類藥物。具有抗炎、抗過敏、抗風(fēng)濕、免疫抑制作用，常用于過敏及自身免疫性疾?。?］。在黃芪多糖注射液中非法添加地塞米松磷酸鈉的情況時(shí)有發(fā)生，為了打擊非法添加行為，故建立黃芪多糖注射液中非法添加地塞米松磷酸鈉的檢查方法迫在眉睫。地塞米松磷酸鈉原料藥和注射液的檢測(cè)方法主要是高效液相法，本研究在此基礎(chǔ)建立了黃芪多糖注射液中非法添加地塞米松磷酸鈉的高效液相檢查方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對(duì)照品來源 地塞米松磷酸鈉對(duì)照品，中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，含量94.7%，批號(hào)H0240805。

1.1.2 樣品來源 黃芪多糖注射液，天津市保靈動(dòng)物保健品有限公司，規(guī)格10 mL:0.2 g，批號(hào):201308021。

1.1.3 試劑試藥 甲醇，色譜純;乙腈，色譜純;稀硫酸，分析純;純化水，自制。

1.1.4 儀器設(shè)備 電子天平:METTLER TOLEDO公司，感量0.00001 g，型號(hào)/編號(hào):AB265-S;高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器型號(hào):Agilent1200;數(shù)控超聲波清洗器:KQ-250DE型，昆山市超聲儀器有限公司;5 mL注射器;0.22 μm混合濾膜。

1.2 方法

1.2.1 陰性樣溶液配制 精密量取黃芪多糖注射液10 mL，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，備用。

1.2.2 地塞米松磷酸鈉對(duì)照品溶液配制 精密稱定地塞米松磷酸鈉對(duì)照品10.06 mg，置100 mL量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，得100 μg/mL對(duì)照品溶液;分別用流動(dòng)相稀釋成濃度為 50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1 μg/mL 的系列對(duì)照品溶液。

1.2.3 地塞米松磷酸鈉供試品溶液配制 精密量取黃芪多糖注射液1 mL，置10 mL量瓶中，精密加入1.2.2項(xiàng)下的對(duì)照品溶液適量，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得 50、20、10、5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 μg/mL的系列樣品溶液。

1.2.4 色譜條件［2］色譜柱Thermo BDS HYPERSIL C18，5 μm，4.6 ×150 mm;流動(dòng)相為三乙胺溶液(取三乙胺7.5 mL，加水稀釋至1000 mL，用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0±0.05)-甲醇-乙腈(55∶40∶5);柱溫30 ℃;進(jìn)樣量10 μL。

1.2.5 專屬性考察 按1.2.4項(xiàng)下色譜條件，分別對(duì)地塞米松磷酸鈉對(duì)照品溶液、供試品溶液和樣品空白溶液和試劑空白溶液進(jìn)行分析。

1.2.6 檢出限 精密量取黃芪多糖注射液1 mL，分別精密加入1.2.2項(xiàng)下的地塞米松磷酸鈉對(duì)照品溶液適量，制成系列添加濃度:0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20 μg/mL。精密量取 10 μL，注入液相色譜儀，按照1.2.4項(xiàng)下液相條件記錄色譜圖。光譜圖不失真的濃度的2倍作為最低檢出限。

1.2.7 回收率試驗(yàn) 精密稱取6份地塞米松磷酸鈉對(duì)照品50 mg置100 mL量瓶中，加黃芪多糖注射液，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，得500 μg/mL樣品溶液;精密量取樣品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，得50 μg/mL的溶液，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，按照1.2.4項(xiàng)下液相條件記錄色譜圖。計(jì)算回收率。

1.2.8 耐用性考察 30、25、20℃ 3個(gè)不同柱溫;200 mL流動(dòng)相中添加甲醇2 mL、甲醇10 mL和甲醇2 mL+乙腈5 mL;3個(gè)不同pH 值2.8、3.0、3.2的流動(dòng)相;3款不同色譜柱(Thermo BDS HYPERSIL C18，5 μm，4.6 ×150 mm;Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18，5 μm，4.6 × 150 mm;Waters Symmtry?C18，5 μm，4.6×150 mm對(duì)分離度、峰純度指示、光譜相似度進(jìn)行考察。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性考察 結(jié)果表明，試劑空白和樣品空白溶液中無地塞米松磷酸鈉吸收峰，供試品色譜圖中地塞米松磷酸鈉與相鄰峰的分離度均大于1.5。峰純度檢查:地塞米松磷酸鈉色譜峰光譜均勻，純度較高，可認(rèn)為單一物質(zhì)。光譜相似度檢查:供試品溶液地塞米松磷酸鈉色譜峰與光譜庫(kù)中地塞米松磷酸鈉對(duì)照品的光譜匹配(圖1～圖6)。

圖1 系統(tǒng)適用性色譜圖

圖2 色譜圖性能

圖3 光譜圖和純度檢查圖

圖4 光譜圖和純度檢查圖

圖5 添加樣品色譜圖

2.2 最低檢測(cè)限

2.2.1 對(duì)照品溶液峰位確立 取1.2.2項(xiàng)下的地塞米松磷酸鈉對(duì)照品溶液(100 μg/mL)適量，用微孔濾膜濾過，精密量取10 μL，注入液相色譜儀，按照1.2.4項(xiàng)下液相色譜條件記錄色譜圖。

圖6 空白基質(zhì)(樣品和試劑)的色譜圖

2.2.2 檢測(cè)限的確立 綜合考慮色譜圖峰形、峰面積和地塞米松磷酸鈉藥物有效濃度等因素，結(jié)果表明，上機(jī)濃度 2 μg/mL，光譜圖失真;上機(jī)濃度5 μg/mL，光譜圖不失真，這樣就確定上機(jī)濃度10 μg/mL為檢出限，即可確定黃芪多糖注射液中地塞米松磷酸鈉的檢測(cè)限為100 mg/L，對(duì)應(yīng)黃芪多糖注射液中含量0.01%(圖7～圖8)。

圖7 檢出限色譜圖

2.3 回收率試驗(yàn) 結(jié)果如表1所示。

表1 黃芪多糖注射液添加地塞米松磷酸鈉回收率試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

圖8 光譜圖和純度檢查圖

2.4 耐用性 柱溫、流動(dòng)相比例、流動(dòng)相pH值和色譜柱的改變對(duì)分離度、峰純度指示、光譜相似度的考察結(jié)果顯示，能夠滿足要求，只是保留時(shí)間變化，柱溫變化:11.916 min、13.822 min和16.343 min;流動(dòng)相組分變化:從11.916 min分別變?yōu)?2.482 min、9.611 min和8.953 min;流動(dòng)相pH值變化:12.478 min、11.916 min和12.974 min;不同色譜柱變化:11.916 min、17.696 min 和 19.095 min。

3 結(jié)論

3.1 黃芪多糖注射液陰性溶液在與地塞米松磷酸鈉對(duì)照品相同保留時(shí)間處，無色譜峰出現(xiàn)，證明黃芪多糖注射液對(duì)地塞米松磷酸鈉的檢查無干擾，即本檢查法對(duì)黃芪多糖注射液適用。

3.2 在黃芪多糖注射液添加對(duì)照品的系列濃度色譜圖中，5、10、20 μg/mL 添加濃度均能可靠地檢出地塞米松磷酸鈉，綜合考慮色譜圖峰形、峰面積和地塞米松磷酸鈉藥物有效濃度等因素，按照制定本方法要求不失真濃度的2倍為檢出限，擬定黃芪多糖注射液中地塞米松磷酸鈉的檢測(cè)限為0.1 mg/mL，對(duì)應(yīng)黃芪多糖注射液中含量0.01%。

3.3 本檢測(cè)方法已于2014年1月16日由中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部以第2508號(hào)公告發(fā)布實(shí)施。

［1］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典獸藥使用指南［M］.

［2］中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典 二○一○年版［S］.