１－磷酸鞘氨醇受體２（Ｓ１ＰＲ２）通過(guò)保護(hù)腸黏膜屏障功能緩解炎癥性腸病的作用

薛海波　　宋冰欣　　丁莉　　馬麗麗　　潘貽飛　　陳壇辀

[關(guān)鍵詞] 1-磷酸鞘氨醇;1-磷酸鞘氨醇受體2;腸黏膜屏障功能;炎癥性腸病

[中圖分類號(hào)] R331.3? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）15-0032-05

Effect of 1-phosphossphingosine receptor 2（S1PR2） on relieving inflammatory bowel disease by protecting intestinal mucosal barrier function

XUE Haibo1? ?SONG Bingxin1? ?DING Li1? ?MA Lili2? ?PAN Yifei3? ?CHEN Tanzhou1

1.Department of Gastroenterology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000，China; 2.Department of Rheumatology and Immunology， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000， China; 3.Department of Colorectal and Anal Surgery， the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University， Wenzhou? ?325000， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of 1-phossphingosine receptor 2（S1PR2） on relieving inflammatory bowel disease （IBD） by protecting the intestinal mucosal barrier. Methods S1PR2 gene knockout mice were constructed. Dextran sulfate sodium salt （DSS） was used to induce colitis. Serum fluorescein isothiocyanate （FITC） concentration was measured for intestinal permeability of mice in vitro and in vivo. The levels of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin-6 （IL-6） and interferon-γ （IFN-γ） in cell suspensions were determined by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. Results The survival rate and body weights of wild-type（WT） mice were higher than those of S1PR2-/- mice， and the differences were statistically significant（P<0.05）. The concentrations of IFN-γ， IL-6 and TNF-α in colon cell suspension of mice in the DSS group were higher than those in the control group， and the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion? S1PR2 alleviates inflammatory bowel disease by protecting intestinal mucosal barrier function.

[Key words] 1-phosphossphingosine; 1-phosphossphingosine receptor 2 （S1PR2）; Intestinal mucosal barrier function; Inflammatory bowel disease

炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是一種胃腸黏膜存在持續(xù)性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致胃腸結(jié)構(gòu)和功能紊亂的特發(fā)性腸道炎癥性疾病，臨床表現(xiàn)為腹瀉、腹痛，甚至可有血便，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn′s disease，CD）。炎癥性腸病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，已知腸道黏膜免疫系統(tǒng)異常反應(yīng)所導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)在IBD發(fā)病中起重要作用，認(rèn)為其是由多因素相互作用所致，主要包括遺傳、免疫因素、環(huán)境和微生物[1]。其治療手段有限，反復(fù)發(fā)作的特性和可能的惡變傾向給臨床醫(yī)師和患者帶來(lái)很大困擾，急需研究其發(fā)病機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。

腸黏膜屏障是機(jī)體抵御外環(huán)境侵襲的重要屏障。腸黏膜屏障主要由機(jī)械屏障、生物屏障、化學(xué)屏障及免疫屏障組成。其中機(jī)械屏障最為重要，機(jī)械屏障由腸上皮細(xì)胞及其連接構(gòu)成，調(diào)控著水和溶質(zhì)的跨上皮運(yùn)輸。腸上皮細(xì)胞間的連接方式有多種，包括緊密連接、粘附連接和縫隙連接及橋粒等[2]。腸上皮緊密連接的損傷參與了多種疾病的進(jìn)展。因此，維持完整的腸上皮細(xì)胞緊密連接對(duì)保護(hù)腸屏障功能、防止細(xì)菌移位及毒性大分子進(jìn)入人體有重要的意義。由細(xì)胞間連接變化引起的細(xì)胞通透性改變導(dǎo)致的腸黏膜屏障功能失調(diào)是IBD的發(fā)病機(jī)制中的一個(gè)關(guān)鍵因素。

1-磷酸鞘氨醇（Sphingosine-1，S1P）是一種在生理和病理?xiàng)l件下參與調(diào)解多種細(xì)胞功能的活性鞘脂。S1P可以直接作為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子或細(xì)胞外通過(guò)激活5個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體（G protein-coupled receptors，GPCRs）發(fā)揮作用[3]。過(guò)去二十年，對(duì)S1P及其受體在健康和疾病中的作用進(jìn)行了大量的研究。研究已經(jīng)表明S1P是多種類型的細(xì)胞增殖、遷移和存活的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[4]。在不同的組織或器官中5種S1PRs的表達(dá)具有差異性[5]。在人腸道內(nèi)，所有5種（Sphingosine-1-phosphate receptors，S1PRs）均能被檢測(cè)到，但是S1PRs表達(dá)水平不一。前期已有文獻(xiàn)報(bào)道，S1P通過(guò)激活S1PR1調(diào)節(jié)粘著連接蛋白E-cadherin的表達(dá)增強(qiáng)腸上皮細(xì)胞屏障功能[6]。同時(shí)也有文獻(xiàn)報(bào)道，S1P通過(guò)Akt依賴途徑防止腸上皮細(xì)胞凋亡[7]。這些研究表明，S1P及其受體能夠促進(jìn)腸上皮細(xì)胞增殖和增強(qiáng)上皮細(xì)胞屏障功能，對(duì)腸黏膜屏障起到保護(hù)作用。S1PR2在腸上皮細(xì)胞增殖和上皮細(xì)胞屏障中的作用未見(jiàn)報(bào)道，而筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，S1PR2在腸上皮細(xì)胞高表達(dá)，是S1P在腸上皮細(xì)胞的主要受體，因而S1PR2對(duì)腸黏膜屏障保護(hù)作用值得研究。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

采用C57BL/6小鼠，8～12周，體重中位數(shù)22.5 g，雌雄不限，生活環(huán)境控溫控濕，具有12 h晝夜循環(huán)，并提供充足食水，每周換籠2次。S1PR2基因敲除小鼠[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK（浙）2018-0017]如前制備[8-9]。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理? 繁殖并驗(yàn)證C57BL/6來(lái)源的S1PR2-/-小鼠品系。利用S1PR2-/-小鼠，并以野生型（Wild type，WT）鼠為對(duì)照。用含有2.5%的硫酸葡聚糖鈉鹽（Dextra sulfare sodium，DSS）的水喂養(yǎng)小鼠7 d，以誘導(dǎo)結(jié)腸炎。1周后更換正常不含DSS的水，繼續(xù)喂養(yǎng)小鼠1周，并在第14天處死。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)。

1.2.2 小鼠一般狀況觀察? 以喂食DSS開(kāi)始算起，取0、4、7和14 d小鼠結(jié)腸和血，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各取WT和KO 6只，解剖小鼠并檢測(cè)結(jié)腸長(zhǎng)度。每天稱量小鼠體重和收取糞便，記錄小鼠體重變化和生存情況。

1.2.3 小鼠腸通透性檢測(cè) 使用異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的葡聚糖（FITC-葡聚糖，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA）測(cè)量活體小鼠腸通透性。采小鼠外周血與磷酸緩沖液（Phosphatic buffer solution，PBS）溶液1∶3體積稀釋，測(cè)血清中FITC含量，進(jìn)而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，先將小鼠禁食6 h，然后給予50 mg/mL的FITC-葡聚糖灌胃處理（0.6 mg/g體重）。1 h后，經(jīng)尾靜脈采血120 μL。然后按照前述方案給予小鼠DSS。14 d后，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束或處死小鼠前同樣給予50 mg/mL FITC-葡聚糖灌胃（0.6 mg/g體重），后經(jīng)心臟采血120 μL。將收集到的血液離心，用PBS溶液1∶1體積稀釋血漿。使用多功能酶標(biāo)儀（BioTek，Winooski，VT，USA）在激發(fā)波長(zhǎng)485 nm和發(fā)射波長(zhǎng)535 nm下測(cè)FITC-葡聚糖濃度。

1.2.4 結(jié)腸組織學(xué)? 10%福爾馬林固定結(jié)腸切片組織，蘇木精和伊紅染色（H&E）。顯微鏡（Olympus IX70，Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan）下觀察。

1.2.5 制備結(jié)腸組織細(xì)胞懸液? 頸椎脫位法處死小鼠，取仰臥位，打開(kāi)腹腔。切取結(jié)腸測(cè)量長(zhǎng)度，清理腸道內(nèi)容物，并用含1%胎牛血清（Foetal bovine serum，F(xiàn)BS）和不含鈣鎂離子的平衡鹽溶液（Free of calcium and magnesium，CMF-HBSS）清洗腸道。將結(jié)腸切至2 mm大小，浸泡在含有3 mM[3]乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的CMF-HBSS中，置于臺(tái)式恒溫振蕩器振蕩，37℃，180 rpm/min。振蕩30 min后離心，用含1 mg/mL Ⅳ型膠原酶和DNA酶I的HBSS溶液消化沉淀1.5 h，300目網(wǎng)篩過(guò)濾去除雜質(zhì)和未消化的組織塊后，得到小鼠結(jié)腸組織的細(xì)胞懸浮液。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）? 將上述得到的小鼠結(jié)腸細(xì)胞懸液離心，用PBS液洗2次，然后用含10%FBS的無(wú)血清細(xì)胞凍存培養(yǎng)基（Roswell park memorial institute，RPMI）1640重懸。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，接種細(xì)胞至24孔板（每孔4×105細(xì)胞），培養(yǎng)24 h。ELISA試劑盒（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）測(cè)上清中腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、γ-干擾素（Interferon-γ，IFN-γ）濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用GraphPad Prism5.0（GraphPad，San Diego，CA），采取單因素方差分析（One-way ANOVA）和鄧肯檢驗(yàn)（Duncan′s test）分析數(shù)據(jù)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S1PR2-/-小鼠易感DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎

本研究構(gòu)建了S1PR2基因敲除小鼠（S1PR2-/-），以正常小鼠作為對(duì)照，比較兩者對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的敏感性。給予小鼠2%DSS溶液共7 d以誘導(dǎo)結(jié)腸炎，最終在第14天處死小鼠。體重減輕30%可視為人道終點(diǎn)。圖1A顯示了小鼠結(jié)腸組織中S1PR2蛋白的表達(dá)，表明成功建立了S1PR2-/-小鼠。2%DSS處理7 d后，WT和S1PR2-/-小鼠的存活率分別為80%和40%，表明DSS處理后S1PR2-/-小鼠的存活率較低（圖1B）。此外，WT小鼠的體重總是高于S1PR 2-/-小鼠，表明S1PR2-/-小鼠的體重下降比WT小鼠更顯著（圖1C）。

將小鼠分為4組（WT組，2%DSS+WT組，S1PR2-/-組，2%DSS+S1PR2-/-組）。如圖1D，血清FITC濃度代表了小鼠腸道通透性，結(jié)果顯示DSS+小鼠的血清FITC濃度高于對(duì)照組小鼠。此外，S1PR2-/-小鼠血清FITC濃度亦高于WT小鼠，表明S1PR2-/-小鼠體內(nèi)存在更嚴(yán)重的腸黏膜損害。圖1E表示，DSS處理后，小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度明顯縮短，且S1PR2-/-小鼠的結(jié)腸縮短比WT小鼠更明顯。接下來(lái)，檢測(cè)四組結(jié)腸組織中S1P蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示DSS處理的WT和S1PR2-/-小鼠中S1P蛋白表達(dá)明顯增加（圖1F）。

2.2 2%DSS+S1PR2-/-小鼠誘發(fā)更嚴(yán)重的腸炎

為研究其結(jié)腸組織病理學(xué)，用H&E染色小鼠結(jié)腸切片，并制備結(jié)腸組織細(xì)胞懸浮液。如封三圖5A所示，對(duì)照組WT和S1PR2-/-小鼠結(jié)腸上皮完整，可見(jiàn)杯狀細(xì)胞，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DSS處理組的WT小鼠腸黏膜變得松弛，盡管黏膜層仍完整，但可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。而DSS處理組的S1PR2-/-小鼠黏膜上皮可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腸屏障結(jié)構(gòu)有實(shí)質(zhì)性破壞，杯狀細(xì)胞消失。

制備的小鼠結(jié)腸細(xì)胞懸液用RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，ELISA法檢測(cè)TNF-α，IL-6和IFN-γ，結(jié)果分別如封三圖5B，封三圖5C和封三圖5D所示。DSS處理組小鼠結(jié)腸細(xì)胞懸液中IFN-γ、IL-6和TNF-α濃度較對(duì)照組水平升高，其中，2%DSS+S1PR2-/-組的細(xì)胞因子水平高于2%DSS+WT組。

3 討論

炎癥性腸病（IBD）是一組不明原因的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎和克羅恩病。IBD發(fā)病機(jī)制目前尚不明確，普遍認(rèn)為與免疫異常、遺傳易感性、腸道菌群失調(diào)以及感染、環(huán)境、心理等因素相關(guān)。近年研究表明，IBD患者均存在腸黏膜屏障受損，這可能會(huì)引起細(xì)胞因子分泌異常、腸黏膜萎縮、通透性改變及腸道菌群移位，導(dǎo)致炎癥的反復(fù)發(fā)作及加重。目前，臨床上治療IBD以免疫抑制劑或激素治療為主，然而這些藥物使用規(guī)范較為嚴(yán)格，不規(guī)范的用法極易產(chǎn)生不良反應(yīng)及耐藥;對(duì)于嚴(yán)重的IBD患者，雖可采取外科治療手段，但也有出現(xiàn)吻合口難以愈合，需要反復(fù)手術(shù)，并有短腸綜合征、超短腸綜合征手術(shù)并發(fā)癥。

近年來(lái)研究表明通過(guò)黏膜修復(fù)或可以誘導(dǎo)IBD患者持續(xù)的臨床緩解，減少住院和手術(shù)次數(shù)，改善患者的生存質(zhì)量[10]。腸黏膜屏障是由機(jī)械屏障、化學(xué)屏障、免疫屏障和生物屏障4個(gè)部分構(gòu)成，其中任何一個(gè)屏障的損傷均會(huì)導(dǎo)致腸黏膜屏障被破壞，致使其功能受損，誘發(fā)腸源性感染[11-12]。腸上皮屏障完整性的破壞與多種病理狀態(tài)有關(guān)。過(guò)去20年，對(duì)S1P及其受體在健康和疾病中的作用進(jìn)行了大量的研究，表明S1P是多種類型的細(xì)胞增殖、遷移和存活的一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。S1P是一種高度活躍的脂質(zhì)信號(hào)分子，具有廣泛的生物活性，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排、血管生成和血管成熟、細(xì)胞增殖和存活、鈣穩(wěn)態(tài)、免疫細(xì)胞遷移以及內(nèi)皮和上皮屏障功能[13-14]。S1P的組織分布分析表明，其在腸道中的含量非常高[15]。有報(bào)道指出，S1P能夠抑制腸上皮細(xì)胞凋亡，調(diào)節(jié)粘連蛋白E-cad的表達(dá)，還可以提高腸上皮細(xì)胞屏障功能[16-17]。

小鼠急性DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎是一種在人體病理生理學(xué)領(lǐng)域常用的腸黏膜屏障損害模型。本實(shí)驗(yàn)中，小鼠結(jié)腸組織中S1PR2蛋白低表達(dá)，表明成功構(gòu)建S1PR2-/-基因敲除小鼠。DSS處理后，S1PR2-/-小鼠的存活率明顯低于WT小鼠，體重下降比WT小鼠更顯著，結(jié)腸縮短比WT小鼠更顯著。S1PR2-/-小鼠血清FITC濃度亦高于WT小鼠，說(shuō)明S1PR2-/-小鼠比WT小鼠對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎更易感。結(jié)腸組織切片H&E染色顯示，對(duì)照組WT和S1PR2-/-小鼠結(jié)腸上皮完整，可見(jiàn)杯狀細(xì)胞，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。DSS處理組的S1PR2-/-小鼠黏膜上皮可見(jiàn)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，腸屏障結(jié)構(gòu)有實(shí)質(zhì)性破壞。本文研究小鼠結(jié)腸組織來(lái)源的炎癥因子IFN-γ、IL-6和TNF-α，結(jié)果表明DSS處理組小鼠結(jié)腸細(xì)胞懸液中IFN-γ、IL-6和TNF-α濃度較對(duì)照組水平升高。這些數(shù)據(jù)表明，DSS在S1PR2-/-小鼠體內(nèi)誘發(fā)了更嚴(yán)重的腸炎。大量研究表明DSS誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎與大量炎癥因子有關(guān)，如IFN-γ、IL-6和TNF-α[18]，這與本研究結(jié)果一致。有研究指出，S1P誘導(dǎo)的DRA表達(dá)上調(diào)是由S1PR2介導(dǎo)的，DRA是參與哺乳動(dòng)物腸道吸收電中性鹽的主要Cl-/HCO3-交換器[19]。最近的幾項(xiàng)研究進(jìn)一步表明，激活S1PR2可以減少活性氧的形成，抑制細(xì)胞死亡，負(fù)調(diào)控巨噬細(xì)胞活化[20]。這些研究結(jié)果說(shuō)明S1PR2還能保護(hù)腸黏膜化學(xué)屏障的完整性，進(jìn)一步提高腸道屏障功能。

筆者目前的研究表明，S1P介導(dǎo)的S1PR2激活在維持腸道屏障功能方面起著關(guān)鍵作用。S1P/S1PR介導(dǎo)的信號(hào)通路是否參與了與屏障功能障礙相關(guān)的胃腸道疾病的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。了解這些信號(hào)通路將為發(fā)掘腸黏膜發(fā)育不全、短腸綜合征等胃腸道疾病的新治療方法提供重要信息。許多研究主要受限于定義不同、研究設(shè)計(jì)不同等，導(dǎo)致對(duì)腸黏膜修復(fù)的定義尚不十分明確，不同藥物的效應(yīng)規(guī)模也無(wú)法準(zhǔn)確估計(jì)。這均有待于制定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的黏膜修復(fù)定義和進(jìn)一步的研究。

綜上所述，腸道屏障功能是維持腸道穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵。本次研究表明，S1PR2通過(guò)保護(hù)腸黏膜屏障功能緩解炎癥性腸病。筆者希望本次研究結(jié)果能為今后研究改善腸黏膜屏障功能、減輕炎癥反應(yīng)、促進(jìn)腸黏膜屏障修復(fù)提供新的方向和思路。

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（收稿日期：2021-01-12）