精胺對(duì)輻射所致氧化損傷H9c2心肌細(xì)胞的影響研究

杜霄，許超，涂彧，周菊英*

機(jī)體的電離輻射損傷一直是放療科醫(yī)生非常關(guān)注的問(wèn)題。輻射可直接作用于細(xì)胞關(guān)鍵靶點(diǎn)，導(dǎo)致DNA單鏈或者雙鏈發(fā)生斷裂；亦可作用于水分子，產(chǎn)生大量自由基，直接攻擊細(xì)胞膜和細(xì)胞核內(nèi)的DNA，造成DNA的間接損傷，引發(fā)不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)而使細(xì)胞膜損傷、各種亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞、酶活性降低和消失，如何避免或者減少這種損傷是目前研究的重點(diǎn)。精胺是一類廣泛分布的多胺，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖以及維持細(xì)胞膜、核酸和離子通道等細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的功能［1-3］。有研究表明，外源性精胺可使大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)收縮，并在一定范圍內(nèi)呈濃度依賴性［4］；細(xì)胞內(nèi)精胺濃度變化可影響細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。目前，精胺和放射導(dǎo)致的心肌氧化損傷之間的關(guān)系并不明確，相關(guān)研究甚少。因此本研究旨在探討精胺類藥物對(duì)輻射所致氧化損傷的心肌細(xì)胞是否具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 研究時(shí)間 2018年12月至2020年12月。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 spermine（美國(guó)sigma公司），H9c2細(xì)胞系（中科院上海細(xì)胞庫(kù)），DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)corning公司），新生胎牛血清（美國(guó)gibco公司），胰蛋白酶（美國(guó)gibco公司），青霉素-鏈霉素溶液（上海碧云天科技有限公司），PBS（上海源培生物科技有限公司），CCK8試劑盒（日本同仁公司），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：A001-1-1，生產(chǎn)批號(hào)：20190628），丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物研究所，貨號(hào)：A003-1-1，生產(chǎn)批號(hào)：20190629），Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（大連美倫生物技術(shù)有限公司：100T，貨號(hào)：MAO220-2，批號(hào)：Feb-28E）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 MCO-18AC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本松下健康醫(yī)療器械株式會(huì)社），倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司），酶標(biāo)儀（MK3型，美國(guó)Thermo公司），DK-500電熱恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），DK-S22電熱恒溫水鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），BY-G20型醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司），西門子primus醫(yī)用直線加速器，流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.4 H9c2心肌細(xì)胞的培養(yǎng) 將H9c2心肌細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 細(xì)胞存活率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞接種于96孔板，104個(gè)細(xì)胞/孔，24 h后加入精胺并分為100 μmol/L組、200 μmol/L組、400 μmol/L組，空白對(duì)照組為加等量不含藥物的培養(yǎng)液，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。放置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12、24、48 h后，在每孔內(nèi)加入100 μl含10 μl新型細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)溶液——CCK8溶液的細(xì)胞培養(yǎng)基，37 ℃下繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的光密度（OD）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率=（加藥細(xì)胞OD值/對(duì)照細(xì)胞OD值）×100%，上述所有實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)3次，取平均值。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為105/孔，接種于6孔板，24 h后分別加入精胺，根據(jù)細(xì)胞存活率的檢驗(yàn)結(jié)果將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、單純輻射組和輻射+100 μmol/L精胺組、輻射+200 μmol/L精胺組，培養(yǎng)24 h，對(duì)單純輻射組和輻射+100 μmol/L精胺組、輻射+200 μmol/L精胺組進(jìn)行X線照射，輻射源為醫(yī)用直線加速器（西門子primus）6 MV X線照射，照射劑量6 Gy，劑量率200 MU/min，輻射視野10 cm×10 cm，用1.5 cm組織等效材料，消除建成區(qū)，機(jī)頭轉(zhuǎn)180°，空白對(duì)照組含等量的DMEM高糖培養(yǎng)基且不予X線照射，于照射后0、12、24、48 h進(jìn)行如下操作：胰蛋白酶消化后，收集細(xì)胞，離心棄上清，用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞沉淀中加入1×Bing buffer工作液，重懸后吸取細(xì)胞懸液至新管，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶（PI）染色液，輕輕混勻。室溫避光孵育15 min，染色孵育后，每管加入400 μl 1×Binding Buffer工作液，混勻后使用流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。細(xì)胞凋亡率=（早期凋亡率+晚期凋亡率）。Annexin V FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)將實(shí)驗(yàn)樣本中正常、壞死、凋亡細(xì)胞區(qū)分開。以FITC和PI熒光做雙參數(shù)點(diǎn)圖，細(xì)胞分為4個(gè)區(qū)，1區(qū)：機(jī)械損傷細(xì)胞（Annexin V FITC-/PI+）；2區(qū)：凋亡晚期或壞死細(xì)胞（Annexin V FITC+/PI+）；3區(qū)：活細(xì)胞（Annexin V FITC-/PI-）；4區(qū)：早期凋亡細(xì)胞（Annexin V FITC+/PI-）。記錄4個(gè)區(qū)細(xì)胞比例并對(duì)各組不同時(shí)間的凋亡率進(jìn)行比較。

1.7 MDA、SOD測(cè)定 選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為104/孔，接種于96孔板，24 h后分別加入精胺，處理?xiàng)l件同1.6，參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中MDA、SOD。

1.8 熒光顯微鏡下觀察H9c2心肌細(xì)胞的形態(tài)變化 選取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9c2心肌細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞的數(shù)量為105/孔，接種于6孔板中，24 h后分別加入精胺，處理?xiàng)l件同1.6，然后進(jìn)行如下操作：預(yù)冷PBS溶液洗滌2次，在細(xì)胞中加1×Binding buffer工作液，再加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，輕輕混勻，室溫避光孵育15 min后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。使用顯微鏡上的藍(lán)光和綠光通道分別觀察FITC和PI。被Annexin V-FITC結(jié)合的細(xì)胞顯示漿膜上有綠色光環(huán)。喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色，膜上有綠色光環(huán)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞存活率 空白對(duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。100 μmol/L組、200 μmol/L組、400 μmol/L組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中24 h細(xì)胞存活率高于12、48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；12 h及48 h細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。處理時(shí)間12 h：四組細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白對(duì)照組細(xì)胞存活率高于100 μmol/L組、200 μmol/L組及400 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；100 μmol/L組細(xì)胞存活率與200 μmol/L組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；100 μmol/L組、200 μmol/L組細(xì)胞存活率高于400 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。處理時(shí)間24 h：四組細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白對(duì)照組與200 μmol/L組細(xì)胞存活率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；空白對(duì)照組細(xì)胞存活率高于100 μmol/L組、400 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；100 μmol/L組細(xì)胞存活率低于200 μmol/L組，高于400 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；200 μmol/L組細(xì)胞存活率高于400 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。處理時(shí)間48 h：四組細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白對(duì)照組細(xì)胞存活率高于100 μmol/L組、200 μmol/L組及400 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；100 μmol/L組細(xì)胞存活率低于200 μmol/L組，高于400 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；200 μmol/L組細(xì)胞存活率高于400 μmol/L組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

表1 四組不同時(shí)間的細(xì)胞存活率比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of cell survival rates in four groups at three different treatment times

表1 四組不同時(shí)間的細(xì)胞存活率比較（±s，n=3）Table 1 Comparison of cell survival rates in four groups at three different treatment times

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與200 μmol/L組比較，bP<0.05；與處理時(shí)間24 h比較，cP<0.05

組別 12 h 24 h 48 h F值 P值空白對(duì)照組 93.53±1.22 93.44±1.83 91.72±1.28 1.45 0.31 100 μmol/L 組 63.36±2.24abc 80.6±0.79ab 60.34±6.51abc 22.40 <0.01 200 μmol/L 組 69.30±6.25ac 90.16±0.40 75.86±3.95ac 18.51 <0.01 400 μmol/L 組 28.70±2.62abc 42.76±1.30ab 24.30±2.02abc 86.00 <0.01 F值 162.00 115.69 156.70 P值 <0.01 <0.01 <0.01

2.2 心肌細(xì)胞凋亡率 處理時(shí)間0 h：四組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組細(xì)胞凋亡率高于單純輻射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；輻射+200 μmol/L精胺組細(xì)胞凋亡率低于輻射+100 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；處理時(shí)間為12 h組、24 h組、48 h組細(xì)胞凋亡情況同處理時(shí)間為0 h組?？瞻讓?duì)照組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中0 h細(xì)胞凋亡率低于12 h、48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；0 h細(xì)胞凋亡率與24 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；12 h細(xì)胞凋亡率低于24 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；12 h細(xì)胞凋亡率與48 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；24 h細(xì)胞凋亡率低于48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。輻射+200 μmol/L精胺組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中24 h細(xì)胞凋亡率低于0 h、12 h和48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；12 h細(xì)胞凋亡率低于0、48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；24 h細(xì)胞凋亡率低于48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。輻射+100 μmol/L精胺組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中24 h細(xì)胞凋亡率低于0、48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；24 h細(xì)胞凋亡率與12 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；12 h細(xì)胞凋亡率低于0、48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；0 h細(xì)胞凋亡率與48 h比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。單純輻射組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；其中0 h細(xì)胞凋亡率低于12、24、48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；12 h細(xì)胞凋亡率低于24、48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；24 h細(xì)胞凋亡率低于48 h，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表2。

表2 四組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of apoptosis rate in four groups at four different treatment times

表2 四組不同時(shí)間的細(xì)胞凋亡率比較（±s，n=3）Table 2 Comparison of apoptosis rate in four groups at four different treatment times

注：與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與單純輻射組比較，bP<0.05；與輻射+100 μmol/L組比較，cP<0.05

組別 0 h 12 h 24 h 48 h F值 P值空白對(duì)照組 0.075±0.014 0.116±0.006 0.094±0.009 0.136±0.013 17.44 <0.01輻射 +200 μmol/L 精胺組 0.224±0.003abc 0.160±0.013abc 0.131±0.004abc 0.200±0.025abc 17.44 <0.01輻射 +100 μmol/L 精胺組 0.262±0.022ab 0.187±0.016ab 0.158±0.010ab 0.236±0.027ab 16.37 <0.01單純輻射組 0.187±0.003a 0.312±0.014a 0.362±0.009a 0.425±0.034a 86.42 <0.01 F值 111.03 129.34 603.87 69.26 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01

2.3 MDA水平及SOD活性 處理時(shí)間為12 h時(shí)：四組MDA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白對(duì)照組MDA水平低于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純輻射組MDA水平低于輻射+100 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純輻射組與輻射+200 μmol/L精胺組MDA水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；輻射+100 μmol/L精胺組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。處理時(shí)間為24 h時(shí)：四組MDA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白對(duì)照組MDA水平低于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純輻射組MDA水平與輻射+100 μmol/L精胺組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；單純輻射組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；輻射+100 μmol/L精胺組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。處理時(shí)間為48 h時(shí)：四組MDA水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白對(duì)照組MDA水平低于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純輻射組MDA水平與輻射+100 μmol/L精胺組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；單純輻射組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；輻射+100 μmol/L精胺組MDA水平高于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

處理時(shí)間為12 h時(shí)：4組SOD活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白對(duì)照組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純輻射組SOD活性高于輻射+100 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純輻射組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；輻射+100 μmol/L精胺組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。處理時(shí)間為24 h時(shí)：四組SOD活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白對(duì)照組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純輻射組SOD活性低于輻射+100 μmol/L精胺組、輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；輻射+100 μmol/L精胺組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。處理時(shí)間為48 h時(shí)：4組SOD活性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；空白對(duì)照組SOD活性高于輻射+200 μmol/L精胺組、輻射+100 μmol/L精胺組、單純輻射組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；單純輻射組SOD活性與輻射+100 μmol/L精胺組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；單純輻射組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；輻射+100 μmol/L精胺組SOD活性低于輻射+200 μmol/L精胺組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3。

表3 四組不同時(shí)間SOD、MDA比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of SOD and MDA levels in four groups at three different treatment times

表3 四組不同時(shí)間SOD、MDA比較（±s，n=3）Table 3 Comparison of SOD and MDA levels in four groups at three different treatment times

注：SOD=超氧化物歧化酶，MDA=丙二醛；與空白對(duì)照組比較，aP<0.05；與單純輻射組比較，bP<0.05；與輻射+100 μmol/L組比較，cP<0.05

組別 12 h 24 h 48 h SOD（U/g） MDA（nmol/mg） SOD（U/g） MDA（nmol/mg） SOD（U/g） MDA（nmol/mg）空白對(duì)照組 29.653±0.839 19.328±0.718 29.292±0.623 20.286±0.378 29.657±1.084 20.656±0.804單純輻射組 20.770±0.503a 23.800±0.425a 19.544±0.578a 25.770±0.721a 17.609±1.330a 32.552±1.260a輻射 +100 μmol/L 19.025±0.652ab 28.894±1.073ab 22.717±0.772ab 25.728±0.735a 17.316±0.572a 31.148±0.485a輻射 +200 μmol/L 24.427±1.142abc 23.319±1.795ac 27.048±0.796abc 20.868±0.267abc 20.552±1.221abc 27.871±1.874abc F值 23.47 23.84 24.65 23.16 21.28 28.06 P值 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 <0.01 0.05

2.4 熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的變化 給予X線照射24 h后，空白對(duì)照組H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞核形態(tài)完整，染色均勻；B為輻射+200 μmol/L精胺組、C為輻射+100 μmol/L精胺組、D為單純輻射組的H9c2心肌細(xì)胞出現(xiàn)不同程度的變化，如細(xì)胞形態(tài)變圓，細(xì)胞核碎裂，染色不均勻等，其中200 μmol/L精胺組的細(xì)胞形態(tài)最接近空白對(duì)照組細(xì)胞，變化程度較輕，見圖1。

圖1 各組細(xì)胞雙染熒光圖（×200）Figure 1 Morphology of cells stained with double immunofluorescence in four groups

3 討論

放射治療被越來(lái)越多地應(yīng)用到惡性腫瘤的治療中，并且成了治療惡性腫瘤的重要方式。但在治療過(guò)程中，由于射線沒有精確的選擇性，在通過(guò)一系列物理、化學(xué)甚至生物過(guò)程作用于腫瘤細(xì)胞導(dǎo)致其死亡的同時(shí)也會(huì)對(duì)腫瘤周圍正常組織細(xì)胞造成損傷甚至凋亡，引起病變周圍、病變以外的器官和組織的放射損傷，產(chǎn)生各種放療并發(fā)癥和毒副作用，即靶外放射損傷。惡性腫瘤的治愈率不斷提高，隨著腫瘤患者的遠(yuǎn)期生存時(shí)間不斷延長(zhǎng)，對(duì)腫瘤患者的關(guān)注由延長(zhǎng)患者的生存期向患者的遠(yuǎn)期生活質(zhì)量上傾斜，由放射治療導(dǎo)致的靶外器官的放射損傷開始成為醫(yī)學(xué)上亟待解決的問(wèn)題。

精胺（天然多胺的一種）是一類帶高密度正電荷的脂肪族的小分子化合物，主要參與多胺的代謝，具有調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和凋亡的功能，在調(diào)節(jié)染色質(zhì)狀態(tài)、維持核酸、基因表達(dá)和離子通道的穩(wěn)定性等方面也具有重要作用［5］。精胺普遍存在于人體細(xì)胞中，其代謝異常會(huì)導(dǎo)致一些細(xì)胞的病理變化［6-7］，影響多種疾病的演變［8-11］。在活細(xì)胞內(nèi)，外源性精胺可以通過(guò)拮抗氧化應(yīng)激、誘導(dǎo)自噬等途徑保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷［12-15］。放射線作用于心肌細(xì)胞可產(chǎn)生大量的自由基［16］，從而觸發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)［17］，導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。有研究表明，外源性精胺可通過(guò)降低輻射誘導(dǎo)的DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)產(chǎn)物，來(lái)增強(qiáng)對(duì)DNA的保護(hù)，從而減少輻射給細(xì)胞帶來(lái)的氧化損傷［18］。也有研究表明，精胺可以減弱P38/JNK等激酶的磷酸化形式表達(dá)，從而減少ROS積累和降低氧化應(yīng)激反應(yīng)［19］，進(jìn)而減少細(xì)胞的凋亡。精胺是否可以保護(hù)正常心肌細(xì)胞免受或降低輻射所致氧化損傷，目前相關(guān)報(bào)道甚少。

本研究結(jié)果顯示，精胺對(duì)心肌細(xì)胞具有放射防護(hù)作用。對(duì)于正常細(xì)胞，精胺濃度可影響細(xì)胞的代謝過(guò)程，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生不同作用。不同濃度的外源性精胺亦會(huì)產(chǎn)生不同的效應(yīng)，如血管環(huán)收縮、內(nèi)皮細(xì)胞損傷、心肌細(xì)胞保護(hù)或損傷等生理或病理變化［20］。CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，精胺濃度為200 μmol/L且處理時(shí)間為24 h時(shí)，心肌細(xì)胞的存活率達(dá)到90%以上，與空白對(duì)照組相比心肌細(xì)胞的存活率無(wú)明顯差異，可知200 μmol/L是心肌細(xì)胞生長(zhǎng)的安全藥物濃度?；诰窛舛?00 μmol/L是細(xì)胞的安全藥物濃度，100 μmol/L組細(xì)胞存活率較空白對(duì)照組及200 μmol/L組低，但24 h時(shí)也達(dá)到了80.6%，而精胺濃度為400 μmol/L時(shí)心肌細(xì)胞損傷嚴(yán)重，12 h及48 h時(shí)存活率不到30%，即使在24 h時(shí)存活率也僅有42.8%。以上結(jié)果說(shuō)明，不同濃度的外源性精胺對(duì)心肌細(xì)胞的效應(yīng)是不同的，而且作用的時(shí)間不同效應(yīng)也不同。因此為探究不同濃度外源性精胺對(duì)輻射損傷心肌細(xì)胞的作用，在后續(xù)試驗(yàn)中選用精胺藥物濃度為100 μmol/L 和 200 μmol/L。

細(xì)胞凋亡是受到嚴(yán)格調(diào)控的細(xì)胞死亡方式，相關(guān)研究證實(shí)細(xì)胞凋亡的異常對(duì)心血管疾病的發(fā)生具有重要影響［21］。本研究結(jié)果顯示，X線照射對(duì)于H9c2心肌細(xì)胞具有明確的損傷作用，精胺處理細(xì)胞后其凋亡率顯著降低，輻射防護(hù)作用與濃度及時(shí)間有關(guān)。濃度為200 μmol/L精胺處理組的細(xì)胞凋亡率較100 μmol/L精胺處理組低。不同精胺濃度處理的細(xì)胞凋亡率均在24 h達(dá)到最低，24 h后細(xì)胞凋亡率增高，可能與時(shí)間有關(guān)。精胺對(duì)于輻射損傷的心肌細(xì)胞的保護(hù)作用可能與其對(duì)細(xì)胞凋亡機(jī)制的影響有關(guān)。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道提示，精胺可通過(guò)上調(diào)抗凋亡蛋白B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）基因的表達(dá)，下調(diào) Bax、 Caspase-3、Caspase-9等細(xì)胞凋亡關(guān)鍵酶的表達(dá)，來(lái)降低各種病理因素導(dǎo)致的心肌細(xì)胞的凋亡［22-23］，但精胺對(duì)輻射所致氧化損傷心肌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

自由基和活性氧是電離輻射重要產(chǎn)物，而氧化應(yīng)激在輻射損傷的發(fā)生中起重要作用［24］。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的主要產(chǎn)物，MDA水平的高低可以反映機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化速率和程度，也能間接反映出細(xì)胞過(guò)氧化損傷的程度。SOD是機(jī)體的抗氧化酶，對(duì)機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用，能清除超氧陰離子自由基（O2-）、保護(hù)細(xì)胞免受損傷。SOD活力高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力，而MDA水平的高低又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。在本研究中，輻射+200 μmol/L組SOD活力明顯下降，而MDA水平顯著升高，其作用效果可能與精胺能夠抑制自由基的產(chǎn)生、脂質(zhì)過(guò)氧化，提高內(nèi)源性抗氧化酶的活力，阻止活性氧對(duì)細(xì)胞膜的損傷，同時(shí)提高細(xì)胞內(nèi)鈉鉀泵活力、降低心肌細(xì)胞內(nèi)鈣超載等機(jī)制有關(guān)［25-26］。

熒光顯微鏡以核碎裂、核濃縮為凋亡特征定性觀察細(xì)胞。本研究結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞核形態(tài)規(guī)整，染色均勻；在X線處理24 h時(shí)，單純輻射組細(xì)胞可見明顯的細(xì)胞核濃縮及碎裂、染色質(zhì)染色不均。200 μmol/L精胺處理后的心肌細(xì)胞細(xì)胞核形態(tài)較規(guī)整、部分碎裂，染色較均勻，其細(xì)胞形態(tài)比100 μmol/L精胺處理組的細(xì)胞更接近正常細(xì)胞。

綜上所述，精胺對(duì)心肌細(xì)胞的輻射損傷具有保護(hù)作用，其保護(hù)作用與藥物作用時(shí)間及濃度有關(guān)。其保護(hù)作用可能與精胺影響細(xì)胞凋亡過(guò)程、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化程度、提高內(nèi)源性抗氧化酶的活力、減輕活性氧對(duì)細(xì)胞的損傷等機(jī)制相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)僅觀察了一定濃度的精胺對(duì)輻射致?lián)p傷的心肌細(xì)胞存在保護(hù)作用，但未探究其中具體保護(hù)機(jī)制，也未對(duì)其他正常組織細(xì)胞進(jìn)行觀察，但為對(duì)正常細(xì)胞的輻射防護(hù)提供了新思路，后期將進(jìn)行進(jìn)一步探索。

作者貢獻(xiàn)：許超進(jìn)行論文的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，文章的可行性分析；杜霄負(fù)責(zé)文獻(xiàn)/資料收集、數(shù)據(jù)整理、論文撰寫；涂彧負(fù)責(zé)論文的修訂，英文的修訂；周菊英負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

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