浙粟3號(hào)的EMS誘變條件篩選

石麗敏 呂學(xué)高 朱正梅 宋費(fèi)玲 盧華兵

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米與特色旱糧研究所 東陽322100）

粟米（Setaria italic L.），北方俗稱谷子，原產(chǎn)于我國(guó)，是最古老的作物之一，去殼后是小米[1]。在禾谷類作物中，粟米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值最高而且營(yíng)養(yǎng)相對(duì)平衡，不僅含有豐富的蛋白質(zhì)(9%～16%)、脂肪(3%～7%)、淀粉，還含有多種氨基酸、維生素和礦質(zhì)元素[2]，能夠滿足人體生理代謝較多方面的需要，調(diào)節(jié)人們的膳食營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，隨著人們物質(zhì)生活水平的不斷提高，小米也受到越來越多的消費(fèi)者喜愛。谷子具有耐貧瘠、耐干旱、抗逆性強(qiáng)等特性，尤其適合在山區(qū)干旱地區(qū)種植[3]。在浙江很多地方都有種植粟米的傳統(tǒng)習(xí)慣，浙粟3號(hào)是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米與特色旱糧研究所從地方種中優(yōu)選純化所育成的適合浙江地區(qū)種植的粟米品種，是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的糯小米類型，缺點(diǎn)就是株高偏高，易倒伏[4]。筆者希望能夠利用誘變手段創(chuàng)制出矮稈突變體材料，對(duì)其進(jìn)行株高改良。甲基磺酸乙酯（Ethylmethan sulfonate，EMS）誘變是一種簡(jiǎn)便高效且應(yīng)用最廣泛的方法，能夠誘發(fā)DNA分子發(fā)生點(diǎn)突變，不易對(duì)染色體造成畸變，穩(wěn)定性好，而且相較于其他誘變方式，EMS誘變成本低廉、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性高，因而被廣泛用于突變體的創(chuàng)造，成為種質(zhì)資源創(chuàng)新和基礎(chǔ)研究獲取突變體材料的一種有效手段[5-6]。目前EMS誘變已成功地應(yīng)用于玉米[7-8]、水稻[9-11]、小麥[11-13]、大豆[14-15]等多種作物的突變體材料創(chuàng)制與育種上，在谷子上應(yīng)用EMS誘變創(chuàng)造突變體材料雖然起步較晚，但是也有一些報(bào)道[3,16]。但由于不同的材料對(duì)EMS誘變劑的敏感性不同，其半致死劑量也存在顯著差異，因此針對(duì)不同的材料確定其適宜的處理?xiàng)l件是化學(xué)誘變工作中關(guān)鍵的一步。本試驗(yàn)以不同預(yù)處理方式、EMS濃度及處理時(shí)間處理浙粟3號(hào)，以確定EMS處理浙粟3號(hào)的適宜條件，提高誘變效率，為獲得更多浙粟3號(hào)突變體材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

浙粟3號(hào)種子由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米與特色旱糧研究所提供，試驗(yàn)用種子經(jīng)過精挑細(xì)選，確保每粒飽滿。

1.2 化學(xué)試劑

1.2.1 EMS原液 甲基磺酸乙酯，純度＞99%，購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2.2 磷酸緩沖液 1 000 mL的磷酸緩沖液配方為6.8 g磷酸氫二鉀和291 mL的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，再加蒸餾水稀釋至1 000 mL,調(diào)節(jié)pH至7。

1.2.3 不同濃度（體積百分?jǐn)?shù)）的EMS溶液 用pH為7的磷酸緩沖液作為EMS的稀釋劑，配制不同濃度的EMS溶液，以0.4%EMS溶液配制為例，用移液槍吸取EMS原液400μL，加入磷酸緩沖液定容至100 mL，搖晃均勻即配制完成，需現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)法，因素A為種子預(yù)處理，設(shè)3個(gè)水平分別為不浸泡的干種子、清水浸種12 h過夜和磷酸緩沖液浸種12 h過夜。因素B為不同EMS濃度（體積百分?jǐn)?shù)）處理，設(shè)5個(gè)水平，EMS濃度依次為0.4%、0.8%、1.0%、1.2%和1.5%。處理C為EMS誘導(dǎo)時(shí)間，設(shè)4個(gè)水平，分別為浸泡處理2 h、4 h、6 h和8 h，共60個(gè)處理組合。處理過程在TS-100C恒溫?fù)u床上進(jìn)行，溫度設(shè)置20℃，振蕩速度100 r/min。EMS處理完后，立即將種子取出于流水下沖洗30 s，然后每個(gè)處理挑選100粒飽滿種子放置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中（濾紙預(yù)先用清水浸透），設(shè)2次重復(fù)，將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度26℃，每日光照16 h，每日下午補(bǔ)清水1次。7 d后調(diào)查發(fā)芽率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

種子發(fā)芽率（%）=發(fā)芽種子數(shù)÷測(cè)定樣品種子數(shù)×100%。利用統(tǒng)計(jì)分析軟件DPSS 19.0對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多因素方差分析和鄧肯氏（Duncan）多重比較。

2 結(jié)果與分析

通過對(duì)預(yù)處理方式、EMS濃度、處理時(shí)間3個(gè)主體對(duì)因變量種子發(fā)芽率的效應(yīng)的檢驗(yàn)表明（表1），預(yù)處理方式、EMS濃度和處理時(shí)間均對(duì)種子發(fā)芽率影響極顯著（P值即Sig值<0.01）。

表1 預(yù)處理方式、EMS濃度、處理時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽率影響的方差分析結(jié)果（主體間效應(yīng)的檢驗(yàn)）

2.1 預(yù)處理方式對(duì)種子發(fā)芽率的影響

結(jié)合表2和圖1可知，3種預(yù)處理方式中，除了1.0%EMS濃度處理2 h清水浸種和干種子發(fā)芽率相同外，清水浸種種子發(fā)芽率最高，磷酸緩沖液浸種種子發(fā)芽率最低。經(jīng)過多重比較分析表明，清水浸種處理與干種子、磷酸緩沖液浸種處理種子發(fā)芽率差異極顯著，干種子與磷酸緩沖液浸種處理種子發(fā)芽率無顯著差異。且3種方式預(yù)處理后，種子發(fā)芽率都隨著EMS濃度增加和處理時(shí)間延長(zhǎng)整體呈降低趨勢(shì)。

2.2 EMS濃度對(duì)種子發(fā)芽率的影響

以不浸種干種子為例，結(jié)合圖1和表2可以看出，當(dāng)EMS濃度低于1.0%時(shí)，隨著EMS濃度增加，種子發(fā)芽率逐漸降低；當(dāng)EMS濃度高于1.0%，處理時(shí)間分別為2 h和4 h，種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，處理時(shí)間分別為6 h和8 h，種子發(fā)芽率呈較平穩(wěn)下降趨勢(shì)。經(jīng)過多重比較分析表明，除了EMS濃度1.0%與1.2%之間種子發(fā)芽率差異不顯著外，其他幾個(gè)濃度間種子發(fā)芽率差異都極顯著，說明種子發(fā)芽率隨著EMS濃度的增加總體呈下降趨勢(shì)不變。

圖1 不同預(yù)處理方式對(duì)種子發(fā)芽率的影響

2.3 EMS處理時(shí)間對(duì)種子發(fā)芽率的影響

由表2和圖2可知，隨著EMS處理時(shí)間的增長(zhǎng)，不同預(yù)處理及不同EMS濃度處理種子發(fā)芽率都是逐漸降低的。多重比較分析結(jié)果表明不同處理時(shí)間之間種子發(fā)芽率差異極顯著。

圖2 各因素影響下種子發(fā)芽率變化趨勢(shì)

表2 不同處理下種子的發(fā)芽率（%）

3 討論

近年來，EMS被廣泛用于多種作物誘變育種和突變體庫(kù)構(gòu)建，種子經(jīng)EMS處理后的致死效應(yīng)最先表現(xiàn)在種子發(fā)芽率，播種后會(huì)繼續(xù)表現(xiàn)為成苗率、生長(zhǎng)量等指標(biāo)的降低及組織器官等形態(tài)的改變。產(chǎn)生這些效應(yīng)的基礎(chǔ)是研究材料中細(xì)胞水平和分子水平的誘變效應(yīng)，包括細(xì)胞分裂受抑制、生長(zhǎng)點(diǎn)分生組織細(xì)胞受損傷、生長(zhǎng)素受破壞、染色體變異及遺傳物質(zhì)核酸和一系列生物大分子蛋白質(zhì)在結(jié)構(gòu)上的變化等[18]。因此，選擇合適的誘變劑量是誘變研究中獲得較高突變頻率、構(gòu)建理想突變體庫(kù)的關(guān)鍵，本研究中把半致死劑量即種子發(fā)芽率的50%作為標(biāo)準(zhǔn)來篩選適宜的誘變條件[19-21]。誘變條件的確定是構(gòu)建一個(gè)成功突變體庫(kù)的重要前提[17]，也是突變體材料創(chuàng)制的第一步。EMS能夠抑制種子的萌發(fā)，不同的EMS處理?xiàng)l件對(duì)種子的發(fā)芽率影響不同，發(fā)芽率又能間接反映誘變效果，研究結(jié)果表明，預(yù)處理方式、EMS濃度、處理時(shí)間均對(duì)種子發(fā)芽率影響極顯著，無論是低濃度或是高濃度的EMS溶液處理浙粟3號(hào)種子，種子萌發(fā)能力均受到抑制作用，且隨著EMS濃度的增大、處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制作用隨之增強(qiáng)，與前人研究結(jié)果一致。

EMS處理不同植物的最佳條件是不同的，例如黃瓜品種SK-1最適的EMS誘變條件為2.1%EMS浸種12 h[22]，高粱品種BTx623最佳的EMS誘變條件是0.2%EMS浸種20 h[23]，花生品種中花5號(hào)的EMS最佳誘變條件是0.9%EMS浸種7 h，或者1.2%EMS浸種5 h[18]。EMS處理同一植物不同品種的最佳條件也是不同的，目前已有報(bào)道的幾個(gè)谷子品種的最佳誘變條件也各不相同，豫谷1號(hào)的最佳誘變條件為種子清水浸種過夜，1.0%EMS處理8 h[24];晉谷21的最佳誘變條件是將提前清水浸過的種子用1.0%EMS處理10 h[25]，十里香的最佳誘變條件是用濃度1.2%EMS處理16 h[17]。以半致死量為標(biāo)準(zhǔn)，本研究確定了浙粟3號(hào)種子的最佳誘變條件：干種子，用濃度0.4%EMS處理4 h。

李偉等[24]研究結(jié)果表明，在相同濃度EMS處理下，清水浸泡過夜的谷子種子較未浸泡的發(fā)芽率低，認(rèn)為在相同濃度、相同處理時(shí)間下使用清水浸種過夜，能夠更好地發(fā)揮EMS的作用，使EMS能較快 地滲入種子胚中。宋振君等[17]發(fā)現(xiàn)用1×PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.2～7.4）提前浸種6.5 h后，在相同濃度EMS處理下，未提前浸種的十里香種子較浸種的種子的發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽率均降低。本研究同時(shí)表明清水浸種、磷酸緩沖液浸種和不浸種在相同濃度EMS處理下，清水浸種發(fā)芽率顯著高于不浸種的種子發(fā)芽率，而不浸種與緩沖液浸種對(duì)種子發(fā)芽率影響差異不顯著，與前人研究結(jié)果不同。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，使用清水浸種過夜，種子充分吸水，根據(jù)滲透勢(shì)原理，相當(dāng)于稀釋了EMS濃度，種子所受到的傷害顯著少于相同濃度、相同處理時(shí)間下的其他種子。