土耳其小麥種質(zhì)條銹病抗性評價和抗病基因分析

焦韓軒, 孫曉媛，黃 碩，劉勝杰，秦 華，吳建輝，曾慶東，王長發(fā)，李海峰，康振生 ，韓德俊

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.西北農(nóng)林科技大學(xué)旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點實驗室，陜西楊凌 712100； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護學(xué)院，陜西楊凌 712100)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾墓阮愖魑镏?，是我國第二大糧食作物，占糧食總產(chǎn)的21.6%，在國民經(jīng)濟中有重要意義[1]。穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)一直是國內(nèi)外小麥育種的重要目標(biāo)。據(jù)國際糧食生產(chǎn)研究所(IFPRI)調(diào)查，2020年世界人口對小麥的需求量由2001年的6億噸增加到10億噸，隨著社會的不斷發(fā)展和人口增長，未來對其需求量會更大[2]。這就需要我們不斷地穩(wěn)定并提高小麥的產(chǎn)量，以滿足人類糧食需求。小麥的穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)受病蟲害、氣候、極端天氣等不利因素的影響，小麥條銹病就是其中之一。小麥條銹菌致病型變異頻繁和抗性資源的不恰當(dāng)使用，是引致小麥品種抗銹性“喪失”、造成病害大流行的主要原因[3]。小麥條銹病是由條形柄銹菌小麥?；?Pucciniastriiformisf. sp.tritici)侵染引起的世界性真菌氣傳病害，可以侵染小麥葉部、桿部以及穗部，具有發(fā)生范圍廣、傳播速度快、危害嚴(yán)重等特點[4]。我國是世界上最大的小麥條銹病流行區(qū)域，且發(fā)生流行規(guī)律比其它國家更加錯綜復(fù)雜，在小麥主產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，對西南、西北等地的冬、春麥區(qū)危害最為嚴(yán)重[5]。我國曾發(fā)生過15次小麥條銹病大流行，流行年份可使小麥減產(chǎn)25%，甚至絕收，威脅小麥的安全生產(chǎn)[6]。2000-2012年間，條中32號(CYR32)和條中33號(CYR33)成為最流行的毒性小種，其對很多小麥抗源具有毒力[7]。條中32號(CYR32)和條中33號(CYR33)小種爆發(fā)流行后，一個新的毒性小種條中34號(CYR34)已經(jīng)成為新的流行性小種[8]。目前CYR34已經(jīng)逐漸傳播到中國小麥主產(chǎn)區(qū)，威脅到小麥安全生產(chǎn)[9]。2020年國內(nèi)條銹病大爆發(fā),雖然對重點發(fā)病區(qū)域進行防控，防控面積達(dá)到1.9億畝次，但最終還是有6 000萬畝小麥發(fā)病，產(chǎn)量受損嚴(yán)重[10]。針對當(dāng)前流行的條銹菌生理小種或致病類型，發(fā)掘新的抗源和抗性基因，培育抗病品種被認(rèn)為是防止條銹病危害、確保小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)最為經(jīng)濟環(huán)保和高效的手段[11-12]。土耳其是小麥等糧食作物起源中心之一，該地區(qū)具有豐富的麥類種質(zhì)資源，包括野生種和近緣野生種、古老的地方種和現(xiàn)代改良品種等，其境內(nèi)小麥種植區(qū)域普遍發(fā)生流行條銹病，在這種選擇壓力下，蘊含著大量抗性種質(zhì)[13]。其豐富和特殊的種質(zhì)資源，可以作為我國抗條銹病育種和抗病基因發(fā)掘的重要源泉。為了解土耳其小麥種質(zhì)對我國當(dāng)前流行小種的抗條銹病水平和抗病類型及其所攜帶的重要抗條銹病基因狀況，擬對177份土耳其小麥進行田間成株期條銹病抗性鑒定，并進行溫室分小種抗病性鑒定，以篩選可以利用的新抗源，豐富小麥抗條銹病育種基因資源，為小麥抗條銹病育種提供理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

177份土耳其小麥種質(zhì)材料由西北農(nóng)林科技大學(xué)胡銀崗教授提供；感病對照品種Avocet S(AvS)由美國華盛頓州立大學(xué)陳賢明教授惠贈；供試感病小麥品種銘賢169和小偃22及小麥條銹菌生理小種CYR32、CYR33、CYR34和致病型PST-Lab.1、PST-Lab.2、PST-V26.1由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥銹病研究室提供，毒性譜參見文獻[14-15]。

1.2 成株期條銹病抗性鑒定

2019-2020連續(xù)兩年在陜西省楊凌區(qū)設(shè)置人工誘發(fā)病圃，對供試材料進行條銹病抗性鑒定。每份供試材料種植2行(行長1 m,行距0.2 m),每隔20個材料種植2行小偃22作為感病對照，供試材料兩側(cè)種植感病品種銘賢169作為誘發(fā)行。每年于3月中旬小麥拔節(jié)期，采用礦物油噴霧法和抖粉法進行混合接種小麥條銹菌CYR32、CYR33、CYR34(1∶1∶1)。于4月下旬至5月中旬，AvS、銘賢169和小偃22充分發(fā)病后(葉片發(fā)病面積達(dá)到80%以上)，調(diào)查發(fā)病情況。2020年在甘肅省天水市和四川省江油市自然誘發(fā)病圃進行抗病性鑒定，種植標(biāo)準(zhǔn)同上，天水于5月中旬至6月中旬，江油于4月下旬至5月中旬，感病對照品種充分發(fā)病后，調(diào)查發(fā)病情況。反應(yīng)型(IT)按照0～9級標(biāo)準(zhǔn)記載[16-17]，可被分為四個級別：0～3為抗病(resistance, R)，4～6為中抗(moderate resistance, MR)，7為中感病(moderate susceptible, MS)，8～9為感病(susceptible, S)，嚴(yán)重度(DS)按照12級標(biāo)準(zhǔn)記載[18]，被分為：0%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%。每隔7 d重復(fù)鑒定一次，調(diào)查三次，并以最高反應(yīng)型和最大嚴(yán)重度作為最終抗病性結(jié)果。

1.3 苗期條銹病抗性鑒定

苗期分小種鑒定于2020年在西北農(nóng)林科技大學(xué)溫室進行。供試小麥材料分別播種于9 cm × 9 cm × 9 cm的花盆中，每份材料種植5～10粒，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待幼苗長到二葉期時進行條銹菌接種。接種方法采用抖粉法，具體步驟如下：(1)將條銹菌夏孢子與滑石粉1：50混合均勻，分別接種條銹菌致病型PST-Lab.1、PST-Lab.2和PST-V26.1；(2)待感病對照充分發(fā)病時進行鑒定，記載反應(yīng)型(IT)，鑒定標(biāo)準(zhǔn)同上；(3)每隔3 d重復(fù)鑒定一次，調(diào)查三次，并以最高反應(yīng)型(IT)作為抗病性結(jié)果。

1.4 抗病基因檢測

用改良CTAB法[19]提取DNA，選擇已經(jīng)開發(fā)的抗條銹病基因Yr5、Yr7、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26、Yr29、Yr30、Yr32、Yr36、Yr46、Yr76、Yr81標(biāo)記進行分子檢測，以便確定抗源的開發(fā)價值和下一步研究方向。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試材料條銹病抗性評價

2.1.1 供試材料成株期鑒定結(jié)果分析

成株期抗病性鑒定結(jié)果(表1)表明，在楊凌人工誘發(fā)病譜表現(xiàn)中抗及以上水平的有79份；在江油和天水自然誘發(fā)病譜表現(xiàn)中抗及以上水平的分別有140、98份；僅有60份在三個環(huán)境中均表現(xiàn)中抗及以上水平。綜合分析表明，成株期供試材料在不同病譜之間抗性水平存在差異，楊凌位于條銹菌春季流行區(qū)，該區(qū)條銹菌毒性結(jié)構(gòu)復(fù)雜，遺傳多樣性豐富，天水位于條銹菌核心越夏異變區(qū)，是秋季菌源基地和新小種策源地，菌源結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜，而江油是條銹菌冬繁區(qū)，菌種結(jié)構(gòu)相對單一，毒力譜窄[7]。因此，供試材料在江油的整體抗病水平比在楊凌和天水的高。

2.1.2 供試材料苗期鑒定結(jié)果分析

分別采用條銹菌致病型PST-Lab.1、PST-Lab.2和PST-V26.1對供試材料進行抗條銹病鑒定。結(jié)果(表1)表明，有36份對PST-Lab.1表現(xiàn)為抗??；有56份對PST-Lab.2表現(xiàn)為抗??；有26份對PST-V26.1表現(xiàn)為抗病；僅有13份對PST-Lab.1、PST-Lab.2和PST-V26.1均表現(xiàn)抗病。整體分析認(rèn)為，供試材料在苗期對三個小麥條銹菌致病類型抗性水平較低。

2.1.3 供試材料條銹病抗病綜合評價

綜合苗期和成株期抗性鑒定結(jié)果分析其抗病類型，可以將供試材料劃分為3種抗條銹病類型：第一類主要有TK-24、TK-55等10份材料，其苗期對所有參試小種以及成株期對甘肅天水、四川江油自然小種均表現(xiàn)為抗病，表明其具有全生育期抗性(ASR)；第二類有TK-1、TK-2等40份材料，其苗期感染部分小種且成株期表現(xiàn)為抗病，屬于對部分致病型失去抗性的全生育期抗病類型(ASRI)；第三類有TK-5、TK-6等47份，其苗期對所有參試小種均表現(xiàn)為不同程度感病，但成株期表現(xiàn)為抗病，屬于成株期抗病類型(APR)(表1)。其余的80份材料呈現(xiàn)不同程度的感病。

2.2 供試材料Yr基因分析

利用Yr5、Yr7、Yr9、Yr10、Yr15、Yr17、Yr18、Yr26、Yr29、Yr30、Yr32、Yr36、Yr46、Yr76和Yr81共15個條銹病抗性基因的分子標(biāo)記對供試材料進行檢測，對其所攜帶的Yr基因進行初步篩查。結(jié)果(表1)表明，有2份材料可能攜帶Yr5；69份材料可能攜帶Yr7；23份材料可能攜帶Yr9；15份材料可能攜帶Yr17；49份材料可能攜帶Yr18；72份材料可能攜帶Yr81；52份材料可能同時攜帶2個抗性基因；16份材料可能同時攜帶3個抗性基因；2份材料可能同時攜帶4個抗性基因；36份材料未檢測到上述Yr基因，其中3份是ASR，4份是ASRI，10份是APR，可能攜帶未檢測的其他已知條銹病抗性基因或未知新基因(表1)。

表1 土耳其小麥種質(zhì)抗條銹病性表現(xiàn)及分子檢測結(jié)果Table 1 Performance of resistance to stripe and the molecular detection in Turkish wheat germplasms

(續(xù)表1 Continued table 1)

3 討 論

抗條銹病基因的有效聚合是提高小麥品種抗性的有效途徑，培育和種植抗病品種是控制小麥條銹病最有效、經(jīng)濟和環(huán)保的方法[20]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，許多抗條銹病基因已經(jīng)被成功定位和克隆，聚合不同類型抗病性基因來改善材料抗病性的策略被廣泛利用[21]。通過分子標(biāo)記輔助選擇，有目的地進行多個抗條銹病基因的聚合已經(jīng)在大麥、棉花、水稻、小麥以及其他作物上實現(xiàn)[22-24]。韓德俊和康振生[25]研究認(rèn)為，Yr基因聚合數(shù)目及類型與小麥抗病水平呈顯著正相關(guān)，聚合多個有效Yr基因可以獲得較高并且相對穩(wěn)定的抗性水平，效果較好的組合有：Yr15+Yr65、Yr9+Yr17等。穆京妹等[26]聚合了源于四倍體小麥的抗條銹病基因Yr64和Yr65，創(chuàng)制了二者的聚合系種質(zhì)，該種質(zhì)在田間對條銹病表現(xiàn)為高抗水平。美國西部的幾個小麥栽培種也是通過聚合Yr5+Yr15、Yr15+Yr17等抗病基因發(fā)展而來[27-28]。本研究結(jié)果表明，Yr17基因能夠提高小麥品種的廣譜抗病性，在多地的檢驗中，攜帶Yr17的多抗性基因聚合小麥品種抗條銹性高且穩(wěn)定持久，如：Yr17+Yr81(TK-25)、Yr5+Yr17+Yr81(TK-55)、Yr17+Yr18(TK-160)等。Yr9定位于1BS/1RS的1RS(黑麥)臂上，被廣泛應(yīng)用于抗病育種，Yr9單獨使用已失去抗性，與其他抗性基因聚合能增強抗性，如：Yr7+Yr9(TK-10),Yr9+Yr81(TK-26)等，韓德俊等[25]研究也證實了這一點。Yr18與Lr34、Pm38、Sr57位于同一位點，同時兼抗葉銹、桿銹和白粉病，Yr18對同一條銹菌的不同生理小種均產(chǎn)生抗性[29]。在所檢測到的含有Yr18的49份材料中,Yr18除單獨存在外, 還以Yr18+Yr81、Yr17+Yr18、Yr7+Yr18+Yr81、Yr5+Yr7+Yr18+Yr81等多個基因聚合形式存在，其抗病性也隨著基因類型組合的不同呈現(xiàn)不同程度的抗性。Gessese等[30]完成了Yr81的克隆，將其定位于染色體6AS上，發(fā)現(xiàn)自小麥地方品種Aus27430。Yr81為成株期抗性基因，其抗性優(yōu)良且持久。含Yr7、Yr18和Yr81種質(zhì)的抗性比單獨攜帶這些基因強，如：TK-24、TK-119比TK-107、TK-142強，與前人研究結(jié)果一致。綜上所述，抗病基因的有效聚合可以提高品種(系)的抗病性并拓寬抗譜，探索賦予此類抗病性的抗病基因數(shù)目或組合方式，對培育持久性抗病品種具有重要意義。

4 結(jié) 論

明確了土耳其小麥種質(zhì)對我國當(dāng)前流行小種的抗條銹病水平和抗病類型以及所攜帶的抗條銹病基因狀況，篩選出了97個抗病材料，其中17份未檢測到任何已知基因，是進一步研究的重點；發(fā)現(xiàn)聚合3～4個有效Yr基因可以獲得較高并且相對穩(wěn)定的抗性水平，效果較好的組合有：Yr7+Yr18+Yr81、Yr5+Yr17+Yr81、Yr5+Yr7+Yr18+Yr81等，為小麥抗條銹病育種提了理論依據(jù)和材料基礎(chǔ)。