枯草芽孢桿菌Q125降解黃曲霉毒素B1發(fā)酵條件優(yōu)化及活性物質(zhì)分析

劉亞楠，彭丹丹，王 敏，張明丹，黃繼紅，劉 娜

河南工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001

黃曲霉毒素(aflatoxin)屬于真菌毒素，主要是由廣泛分布的曲霉、寄生曲霉等產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的次級(jí)真菌代謝物，對(duì)食品安全構(gòu)成巨大風(fēng)險(xiǎn),具有高毒性、誘變性以及致癌性[1-2]。其中黃曲霉毒素B1(aflatoxin B1，AFB1)具有強(qiáng)烈的毒性，是雙呋喃代謝物。此外，黃曲霉毒素對(duì)人和動(dòng)物均有多種毒理學(xué)效應(yīng)，可導(dǎo)致人和動(dòng)物的肝、腎、肺等器官的異常，具有強(qiáng)肝毒性；低劑量可導(dǎo)致免疫力低下、肝功能受損、消化功能紊亂，更容易感染疾??；高劑量可能導(dǎo)致人體損傷，引發(fā)癌變(肝癌)甚至危及生命[3-6]。

目前，黃曲霉毒素可以通過(guò)物理、化學(xué)和生物法降解。由于安全性、營(yíng)養(yǎng)保留以及成本要求等限制，物理和化學(xué)方法在實(shí)際生產(chǎn)中難以推廣使用[7-8]。生物降解對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量、安全和生態(tài)環(huán)境的影響最小，且減少或消除食品和飼料中黃曲霉毒素溫和而有效[9]。Xia等[10]研究發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌JSW-1的上清液對(duì)AFB1的降解率為67.2%。Guan等[11]研究橙色黏球菌ANSM068(Myxococcusfulvus)降解AFB1的最適培養(yǎng)條件為初始pH值7.5、溫度30 ℃，此條件下AFB1降解率76.6%。Kong等[12]采用中心復(fù)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化紅球菌(Rhodococcuserythropolis)降解AFB1的效率，AFB1降解率從28.7%提高到95.8%，較優(yōu)化前提高了2.3倍。盡管這些真菌和細(xì)菌能夠有效降解AFB1，但在實(shí)際使用中受到溫度或低降解率的制約。因此，作者以篩選的枯草芽孢桿菌Q125菌株為研究對(duì)象，進(jìn)行優(yōu)化并提高其降解AFB1的效率，并對(duì)其解毒活性物質(zhì)進(jìn)行初步探究，為進(jìn)一步將枯草芽孢桿菌應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌Q125由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子及發(fā)酵培養(yǎng)基均采用營(yíng)養(yǎng)肉湯(NB)培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏3.0、蛋白胨10.0、NaCl 5.0，pH自然，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

AFB1標(biāo)準(zhǔn)品：生工生物工程(上海)股份有限公司；甲醇(色譜純)：天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司；二氯甲烷：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；硫酸銨、無(wú)水乙醇、丙烯酰胺、四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、過(guò)硫酸銨(AP)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、巰基乙醇、考馬斯亮藍(lán)R-250、冰乙酸、Marker等均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TS-200B型恒溫?fù)u床：上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司；多功能酶標(biāo)儀：瑞士Tecan有限公司；Muitifuge X1R型高速冷凍離心機(jī)：Thermo Fisher公司；PHS-3C型精密酸度計(jì)：上海大普儀器有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一生物科技有限公司；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；LC-2030C型高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

在無(wú)菌環(huán)境下將菌株Q125接種于100 mL NB液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃搖床(180 r/min)培養(yǎng)。0～12 h每2 h取樣測(cè)定D(600)，12～72 h每12 h測(cè)定D(600)，對(duì)照組為NB培養(yǎng)基。橫軸為培養(yǎng)時(shí)間、縱軸為D(600)，繪制生長(zhǎng)曲線[13]。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

將菌種接至滅菌的100 mL NB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床(180 r/min)培養(yǎng)18 h。待菌液D(600)達(dá)到1左右，以5%(V/V)接種量轉(zhuǎn)接至100 mL NB中，置于搖床發(fā)酵36 h，4 ℃、10 000 r/min條件下離心10 min，上清液用0.22 μm濾膜過(guò)濾。將900 μL上清液與100 μL黃曲霉毒素B1(10 μg/mL)混合，置于已滅菌的10 mL離心管中，37 ℃、180 r/min避光培養(yǎng)96 h。無(wú)菌NB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照。分別考察發(fā)酵時(shí)間(24、36、48、60 h)、接種量(1%、5%、10%、15%、20%)、初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)、發(fā)酵溫度(28、31、34、37、40 ℃)對(duì)AFB1降解率的影響。

1.3.3 AFB1降解率的測(cè)定

AFB1的提取及檢測(cè)參考Teniola等[14]方法并略做修改。向反應(yīng)結(jié)束的樣液中加入1 mL二氯甲烷，重復(fù)3次，合并有機(jī)相，氮?dú)獯蹈桑? mL甲醇復(fù)溶，0.22 μm濾膜過(guò)濾，HPLC檢測(cè)。檢測(cè)條件如下。C18色譜柱：SB-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm；流動(dòng)相：V(甲醇)∶V(水)=60∶ 40，流速0.8 mL/min，運(yùn)行時(shí)間11 min，柱溫32 ℃；檢測(cè)器：光電二極管陣列(PDA);檢測(cè)波長(zhǎng)365 nm。AFB1降解率計(jì)算公式如下。

式中：A、B分別表示添加AFB1的對(duì)照峰面積和試驗(yàn)組峰面積。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù) Box-Behnken 設(shè)計(jì)原理，基于單因素試驗(yàn)，選擇合適的因素與水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)曲線

生長(zhǎng)曲線的測(cè)定在微生物學(xué)研究中有著重要的意義，可以直觀反映出細(xì)菌生長(zhǎng)和代謝的規(guī)律。由圖1可知，菌株在0～12 h生長(zhǎng)遲緩，12 h后生長(zhǎng)較快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)24～60 h時(shí)，D(600)趨于穩(wěn)定。因?yàn)榉€(wěn)定期的某些代謝產(chǎn)物的次級(jí)代謝產(chǎn)物在該階段產(chǎn)生，這些產(chǎn)物可能包括抗生素、多肽、某些蛋白或代謝分泌到胞外的酶類，所以穩(wěn)定期是發(fā)酵生產(chǎn)的最適收獲期[15]。因此，須對(duì)剛進(jìn)入穩(wěn)定期前后的發(fā)酵時(shí)間進(jìn)一步研究。

圖1 37 ℃條件下Q125在種子培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of Q125 in seed broth at 37 ℃

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響

發(fā)酵周期的長(zhǎng)短對(duì)菌株降解AFB1有一定的影響，發(fā)酵初期菌體生長(zhǎng)旺盛，能合成大量降解AFB1的活性物質(zhì)。由圖2可知，發(fā)酵36 h，AFB1降解率達(dá)到69.24%。發(fā)酵60 h與36 h的降解效果差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明60 h時(shí)，細(xì)菌進(jìn)入衰亡期，細(xì)胞更容易老化，細(xì)胞存活率逐步下降，降解AFB1的能力下降[16-17]。因此，發(fā)酵時(shí)間36 h為最優(yōu)周期。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)AFB1降解率的影響Fig.2 Effect of fermentation time on the degradation of AFB1

2.2.2 接種量對(duì)AFB1降解率的影響

恰當(dāng)?shù)慕臃N量對(duì)降解AFB1的活性物質(zhì)的高產(chǎn)是至關(guān)重要的。由圖3可知，接種量5%的條件下降解率相對(duì)較高，為70.96%。隨著接種量的增加，降解率呈下降趨勢(shì)?？赡苁怯捎诰w的大量繁殖以至于維持細(xì)胞所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供不應(yīng)求，引起細(xì)胞內(nèi)分解代謝超過(guò)合成代謝，不利于降解產(chǎn)物的產(chǎn)生，同時(shí)不足以滿足發(fā)酵必備營(yíng)養(yǎng)[18-19]。綜合考慮，選擇5%作為適宜菌株接種量。

圖3 接種量對(duì)AFB1降解率的影響Fig.3 Effect of inoculation dosage on the degradation of AFB1

2.2.3 初始pH值對(duì)AFB1降解率的影響

培養(yǎng)基不同初始pH值可能會(huì)影響培養(yǎng)基中微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，以及代謝反應(yīng)中各種酶的活性。由圖4可知，初始pH5.5～7.5時(shí)，降解率保持穩(wěn)定，差異不明顯(P>0.05)。當(dāng)pH值低于5.5或高于7.5時(shí)，AFB1的降解率呈下降趨勢(shì)。這與Guan等[11]研究結(jié)果基本一致。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是過(guò)酸或過(guò)堿改變了培養(yǎng)基的環(huán)境，因?yàn)榧?xì)菌細(xì)胞膜表面電荷性質(zhì)受pH值控制，影響了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性以及對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的汲取[15]。

圖4 初始pH值對(duì)AFB1降解率的影響Fig.4 Effect of initial pH value on the degradation of AFB1

2.2.4 發(fā)酵溫度對(duì)AFB1降解率的影響

溫度會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)酶活力和細(xì)胞膜的通透性，進(jìn)而影響細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。由圖5可知，溫度在28～40 ℃范圍內(nèi)，菌株降解AFB1的能力呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度為37 ℃時(shí)，降解率最高(78.45%)。這與Farzaneh等[20]研究發(fā)現(xiàn)一株枯草芽孢桿菌UTBSP1在發(fā)酵溫度35 ℃時(shí)，上清液對(duì)AFB1降解率最高基本一致。Guan等[21]也報(bào)道了降解AFB1的嗜麥芽窄食單胞菌35-3的最佳降解溫度為37 ℃。

圖5 發(fā)酵溫度對(duì)AFB1降解率的影響Fig.5 Effect of fermentation temperature on the degradation of AFB1

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)與結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，結(jié)合軟件Design Expert 8.0.6確定枯草芽孢桿菌Q125降解AFB1的最優(yōu)水平。試驗(yàn)因素為發(fā)酵時(shí)間(A)、接種量(B)、發(fā)酵溫度(C)，AFB1降解率為響應(yīng)值。因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示，回歸模型及方差分析如表3所示。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface design and results

進(jìn)行回歸分析后，可擬合出AFB1降解率的響應(yīng)面模型:

Y=79.68-2.81A+0.52B-2.14C-1.02AB-0.30AC-0.46BC-6.38A2-3.28B2-5.91C2。

由表3可知，模型P(0.003 1)<0.05，說(shuō)明模型回歸顯著；失擬項(xiàng)P(0.051 1)>0.05，影響不顯著；回歸方程決定系數(shù)R2=0.927 7，說(shuō)明試驗(yàn)所得方程與實(shí)際擬合誤差較小，模型擬合程度良好，可用于枯草芽孢桿菌Q125發(fā)酵條件對(duì)AFB1降解影響的分析與預(yù)測(cè)。利用Design-Expert軟件得到二次回歸方程以及統(tǒng)計(jì)結(jié)果分析，表明試驗(yàn)因素之間交互作用不顯著。

表3 回歸模型方差分析及顯著性檢驗(yàn)Table 3 Regression model variance analysis and significance test

2.4 模型驗(yàn)證

響應(yīng)面模型預(yù)測(cè)表明，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間38.64 h、接種量5.76%、發(fā)酵溫度36.4 ℃時(shí)，AFB1降解率最高，為79.89%。為了驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)與試驗(yàn)測(cè)定值是否一致，在此最優(yōu)水平下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際培養(yǎng)條件，將最佳水平確定為發(fā)酵時(shí)間38.6 h、接種量5.8%、發(fā)酵溫度36 ℃。試驗(yàn)結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌Q125對(duì)AFB1降解率為79.09%，與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.5 菌株Q125發(fā)酵上清液活性組分初步探討

2.5.1 活性組分蛋白電泳

通過(guò)不同硫酸銨飽和度對(duì)AFB1降解率影響的研究可知，當(dāng)飽和度為80%時(shí)，AFB1的降解率達(dá)到最高(56.47%)。這與Song等[22]研究結(jié)論一致。進(jìn)一步對(duì)AFB1活性降解酶分子量進(jìn)行測(cè)定，按照Motomura等[23]的方法對(duì)80%的沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳。由圖6可知，呈現(xiàn)出的蛋白分子質(zhì)量在30～31 kDa和43～66.2 kDa之間。綜上所述，從菌株Q125上清液中分離出來(lái)的粗酶液對(duì)AFB1具有降解活性。

注：M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1為80%飽和硫酸銨沉淀蛋白條帶。圖6 SDS-PAGE電泳圖Fig.6 SDS-PAGE electrophoresis

2.5.2 熱處理、SDS和蛋白酶K對(duì)AFB1降解率的影響

注：熱處理1為煮沸15 min；熱處理2為高溫高壓20 min。圖7 熱處理、蛋白酶K處理、SDS處理的枯草芽孢桿菌Q125細(xì)胞上清液的AFB1降解率(96 h)Fig.7 Degradation of AFB1 by heat-treated, proteinase K, and SDS-treated cell-free supernatant of Bacillus subtilis Q125.(96 h)

由圖7可知，降解溫度為37 ℃時(shí)，蛋白酶K處理與對(duì)照組相比降解AFB1的能力降低了5.05%(P<0.05)；SDS處理后，AFB1降解能力顯著降低了36.72%(P<0.05)。上述結(jié)果表明，降解過(guò)程中菌株Q125的上清液可能含有蛋白質(zhì)或酶。Sangare等[24]研究銅綠芽孢桿菌N17-1降解AFB1時(shí)，蛋白酶K處理培養(yǎng)上清液，降解AFB1的能力降低了12.3%；用蛋白酶K+SDS處理培養(yǎng)上清液，降解活性顯著降低34.0%。Shu等[25]研究結(jié)果表明蛋白酶K略影響降解活性(P>0.05)；而SDS處理時(shí)，降解活性明顯下降。更重要的是熱1和熱2處理上清液時(shí)，降解活性沒有下降，反而增強(qiáng)了AFB1的降解效果。此類現(xiàn)象在其他微生物中也被發(fā)現(xiàn)，稱為酶的熱激活現(xiàn)象。如Wang等[26]發(fā)現(xiàn)Fusariumsp.WCQ3361的降解活性物質(zhì)具有較高的熱穩(wěn)定性，在沸水浴10 min條件下，AFB1的降解能力仍保留99.40%。Sangare等[24]研究發(fā)現(xiàn)上清液沸水浴10 min時(shí)，AFB1降解活性提高3.49%。此外，Kavitha等[27]從多黏菌芽孢桿菌菌株VLB16中分離出具有耐熱性的抗真菌蛋白，在121 ℃、15 min處理?xiàng)l件下仍保持很高的活性。

2.5.3 降解溫度對(duì)AFB1降解率的影響

菌株Q125培養(yǎng)上清液在不同降解溫度下對(duì)AFB1的降解情況不同(圖8)。在培養(yǎng)96 h的條件下，降解溫度40～60 ℃時(shí)，AFB1的降解率隨著溫度升高顯著上升(P<0.05)。降解溫度為60 ℃時(shí)，AFB1降解率達(dá)到100%，且降解溫度60～80 ℃時(shí)，降解率仍保持在100%，再次證明菌株Q125上清液中活性成分有較好的熱穩(wěn)定性。這與Shu等[25]發(fā)現(xiàn)BacillusvelezensisDY3108培養(yǎng)上清液可在20～90 ℃的較寬溫度范圍內(nèi)呈現(xiàn)較高的降解率的結(jié)論一致。

圖8 降解溫度對(duì)菌株Q125降解AFB1的影響Fig.8 Effect of degradation temperature on AFB1degradation by Bacillus subtilis Q125

3 結(jié)論

枯草芽孢桿菌Q125在降解AFB1的過(guò)程中，發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)AFB1降解率有顯著影響。通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵時(shí)間38.6 h、接種量5.8%、發(fā)酵溫度36 ℃，AFB1的降解率提升了14.23%。以最優(yōu)發(fā)酵條件為基礎(chǔ)，研究熱處理、蛋白酶K、SDS及降解溫度對(duì)降解AFB1的影響，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)上清液中的蛋白質(zhì)或酶可能是降解AFB1的原因，并且具有較廣的反應(yīng)溫度范圍以及優(yōu)異的熱穩(wěn)定性。發(fā)酵和降解條件的優(yōu)化顯著提高了枯草芽孢桿菌Q125發(fā)酵上清液對(duì)AFB1的降解效率，降解溫度在60～80 ℃時(shí)，降解率均能達(dá)到100%。