巨噬細(xì)胞極化失衡與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病活動(dòng)及骨侵蝕的相關(guān)性

王東軼，沈俊逸，陸 樂，蔡 輝

0 引 言

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是多關(guān)節(jié)對(duì)稱性累及的多種免疫細(xì)胞參與的慢性炎癥性疾病，嚴(yán)重者可致殘，影響患者生活質(zhì)量且造成社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?；ぞ奘杉?xì)胞(synovial macrophages，SMs)是參與RA滑膜炎癥和骨侵蝕的重要免疫細(xì)胞。在RA患者的血液和滑膜液中存在極化不平衡的現(xiàn)象，其中滑膜液中的巨噬細(xì)胞失衡更為明顯[1]。鑒于不同組織體液中巨噬細(xì)胞極化情況可能存在差異，進(jìn)一步深入研究RA患者滑膜組織中巨噬細(xì)胞極化的情況尤為必要；但目前相關(guān)研究鮮有報(bào)道。本研究運(yùn)用免疫熒光染色，回顧性分析關(guān)節(jié)置換或滑膜切除術(shù)的RA、膝骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)和創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎(post-traumatic osteoarthritis，PTOA)患者的SMs表面標(biāo)志物CD86、iNOS和CD206的表達(dá)特點(diǎn)，并進(jìn)一步分析巨噬細(xì)胞表型和RA疾病活動(dòng)以及骨侵蝕的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性分析2016年1月1日至2020年12月31日東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治RA、OA和PTOA患者臨床資料。RA診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟共同發(fā)布的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎分類標(biāo)準(zhǔn)[2]；OA和PTOA診斷標(biāo)準(zhǔn)參考2018年中華醫(yī)學(xué)會(huì)骨科學(xué)分會(huì)更新的骨關(guān)節(jié)炎診療指，其中PTOA具有外傷或其他手術(shù)病史。

1.2組織標(biāo)本免疫熒光染色石蠟切片置于65 ℃烘箱中烘烤1 h，脫蠟至水后置于EDTA抗原修復(fù)液中高壓修復(fù)。再將切片入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。滴加二抗相同宿主的血清，封閉30 min。在切片上滴加一抗，4 ℃濕盒內(nèi)過夜孵育。再滴加二抗，室溫30 min(避光孵育)。在切片上滴加DAPI，染核10 min。

1.3觀察指標(biāo)應(yīng)用免疫熒光染色處理各組患者滑膜組織后，利用熒光顯微鏡(Nikon，Ts2R)攝片并使用image J軟件自動(dòng)定量分析CD68+iNOS+SMs和CD68+CD206+SMs的數(shù)量，計(jì)算CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值。收集RA患者的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，包括類風(fēng)濕因子(rheumatoid factor，RF)、抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體(anti-cyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein，CRP)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate，ESR)。根據(jù)關(guān)節(jié)壓痛數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹數(shù)和ESR計(jì)算改良疾病活動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)(disease activity score in 28 joints，DAS28)(3變量)評(píng)分。

1.4影像學(xué)指標(biāo)采用Larsen診斷分級(jí)(0～5級(jí))評(píng)估RA患者骨侵蝕的情況：0級(jí)=正常；1級(jí)=輕微改變，軟組織腫脹、關(guān)節(jié)骨質(zhì)疏松、關(guān)節(jié)狹窄；2級(jí)=決定性改變，一個(gè)或多個(gè)小侵蝕；3級(jí)=顯著變化，明顯侵蝕；4級(jí)=嚴(yán)重變化，較大侵蝕，僅保留部分原始關(guān)節(jié)面；5級(jí)=殘缺性改變，原始關(guān)節(jié)面已消失，可能出現(xiàn)嚴(yán)重畸形[3-4]。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料共收集病例189例。其中RA患者95例，年齡28～81歲，平均(56.93±11.72)歲，男10例、女85例；OA患者76例，年齡49～86，平均(67.14±8.62)歲，男16例、女60例；PTOA患者18例，年齡26～61歲，平均(47.56±8.88)歲，男11例、女7例。3組患者年齡、性別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。根據(jù)DAS28-3評(píng)分對(duì)95例RA患者進(jìn)行分組：評(píng)分≥2.6 分為RA活動(dòng)組，共74例，其中男7例、女67例，平均(58.15±10.38)歲；評(píng)分<2.6 分為RA緩解組，共21例，其中男3例、女18例，平均(52.62±15.08)歲。

2.2RA組、OA組和PTOA組巨噬細(xì)胞表型的比較CD68+iNOS+SMs、CD68+CD206+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs在3組中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。進(jìn)一步采用Nemenyi檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果RA組中的CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs明顯高于OA組和PTOA組；CD68+CD206+SMs則反之(P<0.01)。見圖1，表1。

RA：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；OA：膝骨關(guān)節(jié)炎；PTOA：創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎；SMs：滑膜巨噬細(xì)胞；*表示P<0.01

表 1 RA、OA和PTOA的巨噬細(xì)胞表型

2.3RA活動(dòng)組與緩解組巨噬細(xì)胞表型比較RA活動(dòng)組中CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs明顯高于RA緩解組，CD68+CD206+SMs則反之，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

表 2 RA活動(dòng)組和緩解組的觀察指標(biāo)

2.4巨噬細(xì)胞表型與RA疾病活動(dòng)指標(biāo)及DAS28-3評(píng)分的相關(guān)性CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs皆與RA疾病活動(dòng)指標(biāo)及DAS28-3評(píng)分呈正相關(guān)，CD68+CD206+SMs則呈負(fù)相關(guān)(P<0.01)。見表3。

表 3 巨噬細(xì)胞表型與RA活動(dòng)性指標(biāo)及DAS28-3評(píng)分的相關(guān)性[r(P)]

2.5巨噬細(xì)胞表型與Larsen診斷分級(jí)的相關(guān)性CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs與其呈正相關(guān)，CD68+CD206+SMs反之，且具有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖2。

圖 2 巨噬細(xì)胞表型與Larsen診斷分級(jí)的相關(guān)性

2.6巨噬細(xì)胞表型對(duì)RA疾病診斷價(jià)值巨噬細(xì)胞表型對(duì)RA疾病診斷效能3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)RA的診斷均具有一定意義，(AUC>0.5，P<0.01)。其中CD68+CD206+SMs的敏感度更高，而CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值的特異度和總體診斷價(jià)值更高。見圖3，表4。

圖 3 巨噬細(xì)胞表型診斷RA的ROC曲線

表 4 巨噬細(xì)胞表型的疾病診斷評(píng)價(jià)

巨噬細(xì)胞表型對(duì)RA疾病活動(dòng)度診斷效能3項(xiàng)指標(biāo)對(duì)RA疾病活動(dòng)度的診斷均具有一定意義(AUC>0.5，P<0.01)。其中CD68+CD206+SMs的敏感度、特異度和總體診斷效能更高，見圖4，表5。

圖 4 巨噬細(xì)胞表型診斷RA活動(dòng)度的ROC曲線

表 5 巨噬細(xì)胞表型的疾病活動(dòng)度診斷評(píng)價(jià)

3 討 論

SMs是構(gòu)成RA滑膜組織的重要細(xì)胞。它主要來源于常駐組織的巨噬細(xì)胞和循環(huán)中的單核細(xì)胞，但其確切的起源和功能尚未完全清楚[5]。SMs數(shù)量增加是RA病情活動(dòng)的早期標(biāo)志和炎癥維持的重要特征，但事實(shí)上SMs在關(guān)節(jié)炎癥發(fā)生和發(fā)展過程的作用具有異質(zhì)性，不同的巨噬細(xì)胞在體內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥過程中的功能各異，如CX3CR1+襯里巨噬細(xì)胞通過緊密連接形成免疫屏障，可隔離關(guān)節(jié)和控制炎癥，一旦屏障紊亂，循環(huán)單核細(xì)胞來源的促炎巨噬細(xì)胞內(nèi)流，并產(chǎn)生白介素(IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等促炎細(xì)胞因子，加重關(guān)節(jié)炎癥[6-7]。

組織微環(huán)境和細(xì)胞因子的刺激可誘導(dǎo)SMs表型和功能的改變。90年代早期，研究者們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞在不同細(xì)胞因子刺激下極化的兩種表型，M1型巨噬細(xì)胞表面表達(dá)CD80、CD86、CD282、主要組織相容性復(fù)合體II類分子和iNOS等，向T細(xì)胞呈遞抗原，產(chǎn)生TNF-α、IL-1β、IL-6以及活性氧和一氧化氮，發(fā)揮致炎作用；M2型巨噬細(xì)胞表面表達(dá)CD163、CD206和CD200R，分泌IL-10、轉(zhuǎn)化生長因子和血管內(nèi)皮生長因子等，發(fā)揮抗炎作用并修復(fù)受損組織。隨后的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞極化呈動(dòng)態(tài)連續(xù)性，即在多因素影響下這2種極端表型之間存在連續(xù)的中間表型[8]。但M1和M2表型仍是2種極端狀態(tài)的典型表型，且在微環(huán)境發(fā)生改變時(shí)巨噬細(xì)胞極化具有可逆性[9]。因此通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化來改善RA滑膜炎癥，有望成為新的免疫治療目標(biāo)。

已有諸多研究表明在RA患者或動(dòng)物模型的外周血液和關(guān)節(jié)腔積液中存在巨噬細(xì)胞極化不平衡的現(xiàn)象[10-12]；但不同體液或組織中的巨噬細(xì)胞極化情況可能存在差異，且目前針對(duì)RA患者滑膜組織中SMs表型的研究較少。本研究回顧性分析了RA、OA和PTOA患者的滑膜組織中SMs表型的特點(diǎn)，結(jié)果顯示RA患者的滑膜組織中CD68+iNOS+SMs數(shù)目居多，且CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值明顯高于OA和PTOA患者，這與既往研究所報(bào)道的RA患者關(guān)節(jié)腔積液中巨噬細(xì)胞極化情況大致相同[1]。此外，RA活動(dòng)組中的CD68+iNOS+SMs和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs也顯著高于RA緩解組，CD68+CD206+SMs則反之。iNOS和CD206分別是M1表型和M2表型巨噬細(xì)胞的表面標(biāo)記物，RA疾病活動(dòng)期的患者滑膜組織中數(shù)目增多的CD68+iNOS+SMs可能產(chǎn)生了促炎細(xì)胞因子和趨化因子，進(jìn)而促進(jìn)滑膜炎癥和骨破壞，而CD68+CD206+SMs水平增高則有利于抗炎和組織修復(fù)。

不可逆的骨侵蝕也是RA的特征性表現(xiàn)，而Larsen診斷分級(jí)是一種通過X片評(píng)估RA骨侵蝕的經(jīng)典方法[4]。本研究中CD68+iNOS+SMs與Larsen診斷分級(jí)呈正相關(guān)，而CD68+CD206+SMs則呈負(fù)相關(guān)，說明這兩種巨噬細(xì)胞表型與骨侵蝕密切相關(guān)，這也可能與炎癥本身會(huì)抑制骨形成和促進(jìn)骨吸收有關(guān)[13]。相關(guān)研究證實(shí)了炎性細(xì)胞因子如中性粒細(xì)胞、腫瘤壞死因子-α、IL-6和IL-1等可刺激破骨細(xì)胞生成，抑制成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨質(zhì)形成和修復(fù)，最終導(dǎo)致骨侵蝕[14, 15]，其中TNF-α可以直接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞分化為破骨細(xì)胞參與骨破壞。

根據(jù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究顯示，RA患者血清和關(guān)節(jié)炎積液中的巨噬細(xì)胞極化情況與疾病活動(dòng)度相關(guān)[16]。Alivernini等[9]分析了治療初期活動(dòng)性RA、耐藥活動(dòng)性RA、疾病緩解RA和健康志愿者的SMs亞群，發(fā)現(xiàn)MerTKposCD206posSMs與疾病活動(dòng)呈負(fù)相關(guān)，在病情緩解者的滑膜組織中比例更高，可驅(qū)動(dòng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化并抑制效應(yīng)T細(xì)胞活性。本實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了CD68+CD206+SMs數(shù)目與RF、anti-CCP、CRP、ESR等RA疾病活動(dòng)指標(biāo)以及DAS28-3評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，此外，我們還發(fā)現(xiàn)CD68+iNOS+SMs數(shù)目和CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值與RA疾病活動(dòng)指標(biāo)以及DAS28-3評(píng)分呈正相關(guān)，其中CD68+iNOS+SMs數(shù)目對(duì)RA疾病活動(dòng)度的診斷價(jià)值更高，有望成為評(píng)估病情活動(dòng)情況和治療效果的新指標(biāo)。

綜上所述，RA患者滑膜組織中CD68+iNOS+SMs明顯高于OA和PTOA患者，參與RA的滑膜炎癥和骨侵蝕，并與RA疾病活動(dòng)呈正相關(guān)，CD68+CD206+SMs則反之。此外，CD68+iNOS+SMs/CD68+CD206+SMs比值和CD68+iNOS+SMs數(shù)目分別在RA疾病診斷和活動(dòng)度診斷方面具有較高效能。鑒于巨噬細(xì)胞極化與RA疾病活動(dòng)的密切相關(guān)性，期待更多實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步探索巨噬細(xì)胞在RA發(fā)病機(jī)制中的具體作用，為靶向性治療RA提供新思路。