全反式維甲酸治療上皮性卵巢癌的分子機(jī)制研究進(jìn)展

柳一欣綜述，孔 璐審校

0 引 言

近十幾年來，由于生活方式的改變和平均壽命的延長，中國女性卵巢癌的發(fā)病率和致死率逐年上升，其中上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma,EOC)約占85%～90%，是最常見的卵巢癌組織亞型[1]。早期EOC癥狀隱蔽，確診時(shí)大多已至晚期，臨床常用手術(shù)聯(lián)合化學(xué)療法進(jìn)行晚期EOC治療，但鉑類抗腫瘤藥物不僅易導(dǎo)致如急性腎損傷等各類不良反應(yīng)[2]，而且后期機(jī)體耐藥反應(yīng)明顯，患者復(fù)發(fā)率高，新型分子靶向藥的應(yīng)用或有望提高EOC患者的生存率。

全反式維甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)是目前熱門的癌癥治療靶向藥，臨床中主要用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)，其聯(lián)合常規(guī)的化療方案可以改善老年急性髓樣白血病患者的生存率[3]。ATRA廣譜的抗癌性、廣泛的藥物來源、低廉低毒等特性，使其成為極有潛力的抗卵巢癌新藥[4]。有研究表明，大量攝入維生素A和β胡蘿卜素(維生素A前體)能夠降低罹患卵巢癌的風(fēng)險(xiǎn)。維生素A在肝中生成視黃醇，進(jìn)入靶細(xì)胞后被脫氫酶氧化成維甲酸。ATRA的下游信號(hào)通路多樣，大多數(shù)ATRA在核內(nèi)與維甲酸核受體(retinoic acid receptors,RARs)和維甲類核受體特異性結(jié)合，激活位于維甲酸靶基因啟動(dòng)子上的維甲酸反應(yīng)元件(retinoic acid responsive elements,RAREs)，進(jìn)而調(diào)控下游基因轉(zhuǎn)錄，即ATRA的經(jīng)典作用途徑。

相較于健康女性對(duì)照組，EOC患者的血漿ATRA含量明顯降低[5]。ATRA治療EOC的分子機(jī)制在近年來得到廣泛研究。本文主要就ATRA對(duì)EOC細(xì)胞增殖、分化、凋亡通路及干細(xì)胞特性的調(diào)節(jié)機(jī)制作一綜述。

1 ATRA干擾EOC增殖的信號(hào)通路

研究表明，ATRA將EOC細(xì)胞系(COC2、CAOV3、COC1、3AO、HO8910等)的有絲分裂進(jìn)程阻滯在G1/G0期[6]。經(jīng)ATRA處理后，ATRA敏感株CAOV3與ATRA不敏感株SKOV3胞內(nèi)細(xì)胞周期蛋白A、B、E(cyclin A、B、E)和周期蛋白依賴性激酶2、4、6的含量無明顯差別，但ATRA敏感株CAOV3中一系列周期蛋白依賴性激酶抑制因子(cyclin-dependent-kinase inhibitor,CDKi)的含量卻明顯升高。大量實(shí)驗(yàn)表明，CDKi中的P16、P21和P27是ATRA治療的主要靶向分子。

P16基因是人類癌癥常見的突變基因，可在G1期抑制cyclinD/CDK4/6復(fù)合物活性，進(jìn)而抑制pRB-E2F通路，阻滯癌細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程。EOC近半數(shù)樣本中存在P16基因低表達(dá)現(xiàn)象，這與P16基因啟動(dòng)子的高甲基化狀態(tài)有關(guān)[7]。研究證明，ATRA可以通過降低白血病細(xì)胞系 U937的P16基因啟動(dòng)子的甲基化程度，進(jìn)而恢復(fù)P16蛋白的表達(dá)量[8]，類似分子機(jī)制在EOC中有待證實(shí)。此外，盡管ATRA敏感株CAOV3和不敏感株SKOV3的P16蛋白含量差異顯著，但P16基因啟動(dòng)子上未檢測到RAREs，且ATRA給藥量與P16基因表達(dá)量間無顯著正相關(guān)[9]，由此可見，ATRA不是直接促進(jìn)P16基因轉(zhuǎn)錄實(shí)現(xiàn)其療效。

P21基因在阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程中同樣發(fā)揮著重要作用。在EOC中，ATRA與受體RARβ2特異性結(jié)合，該復(fù)合物激活P21基因啟動(dòng)子上的RAREs，促進(jìn)P21基因轉(zhuǎn)錄[10]。P21蛋白不僅能抑制CDK1和CDK2的活性，還可以直接抑制E2F1基因轉(zhuǎn)錄活性，降低細(xì)胞的異常增殖[9]。

P27基因也是關(guān)鍵的抑癌基因之一，ATRA可以通過多種途徑提高EOC內(nèi)P27Kip1蛋白含量。首先，ATRA可以提高P27Kip1蛋白的穩(wěn)定性。Radu等[11]的研究顯示，在細(xì)胞系CAOV3中，ATRA通過誘導(dǎo)P27Kip1上組蛋白H3第10位絲氨酸(Serine10,S10)殘基磷酸化，進(jìn)而增加P27Kip1蛋白的穩(wěn)定性。其次，ATRA還可以降低P27蛋白的降解量。使用ATRA將降低卵巢癌細(xì)胞中S期激酶相關(guān)蛋白2的含量，從而抑制其對(duì)P27Kip1蛋白的泛素化，減少蛋白酶體對(duì)P27Kip1蛋白的降解[11]。P27Kip1蛋白的氨基端可以與CDK2結(jié)合，抑制CDK2對(duì)cyclin E的催化作用，阻滯細(xì)胞周期的進(jìn)程而起到治療效果。

除上述CDKi的作用外，Wnt/β-catenin通路也是調(diào)控CDK活性的重要通路之一。在癌細(xì)胞中，Wnt通路被異常激活，激活的β-catenin蛋白向細(xì)胞核遷移并與核內(nèi)TCF/LEF等轉(zhuǎn)錄因子相作用，導(dǎo)致癌細(xì)胞異常增殖。研究表明，在EOC的治療過程中，ATRA可以通過降低β-catenin基因表達(dá)量，阻斷Wnt/β-catenin通路，使癌細(xì)胞中該分子通路趨向正常，進(jìn)而抑制cyclinD1的活性，避免G1期縮短所導(dǎo)致的增殖過快，從而起到治療效果[12]。

對(duì)視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma,Rb)蛋白的調(diào)控也是ATRA治療EOC的重要分子途徑之一，其中研究較透徹的是Rb2/P130通路。一方面，ATRA可以增加Rb蛋白的活性。通過CDKi和Wnt/β-catenin等分子途徑，ATRA使cyclin/CDK復(fù)合物進(jìn)入低活性狀態(tài)，無法磷酸化Rb2蛋白的絲氨酸或蘇氨酸殘基?；罨腞b2蛋白可以與E2F轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，并招募組蛋白修飾、染色體重構(gòu)蛋白質(zhì)等染色質(zhì)抑制因子，使E2F在G1期的基因轉(zhuǎn)錄功能受到抑制，最終將卵巢癌細(xì)胞阻滯在G1/G0期。另一方面，ATRA也能增加Rb2/P130蛋白的穩(wěn)定性從而提高其總含量。在細(xì)胞系CAOV3中，ATRA可以促進(jìn)蛋白磷酸酶2A的氨基端與Rb2/P130羧基端上的核定位序列(nuclear localization signals,NLS)NLS1和NLS2相結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)NLS序列中S1080 and T1097殘基脫磷酸化，使核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白α(importinα)得以與該位點(diǎn)相結(jié)合。隨后，核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白β將介導(dǎo)importinα/Rb2/P130復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞核，使核內(nèi)低磷酸化的Rb2/P130含量增加。由于Rb2/P130在低磷酸化狀態(tài)下不易被泛素化，故此時(shí)蛋白酶體對(duì)Rb2/P130的降解量顯著減少，核內(nèi)Rb2/P130的積累量增加，進(jìn)而通過下游E2F通路起到抑癌效果[13]。

然而，ATRA對(duì)G1/G0的阻滯作用卻并不發(fā)生在EOC細(xì)胞系SKOV3中。早期研究顯示，SKOV3較CAOV3細(xì)胞中P27Kip1蛋白含量較低且不隨ATRA的處理時(shí)長的增加而升高，抑制分裂效果甚微，這被Radu等[11]證明是由于SKOV3細(xì)胞中P27Kip1的S10位點(diǎn)無法被ATRA磷酸化所致。此外，P16基因的異位表達(dá)使SKOV3細(xì)胞對(duì)ATRA的敏感性提高，而原ATRA高敏感細(xì)胞系在P16蛋白缺失后呈現(xiàn)出ATRA治療抗性，說明SKOV3的低P16蛋白水平也是其無法響應(yīng)ATRA治療的重要原因[9]。Fields等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在施加ATRA治療前，SKOV3與CAOV3細(xì)胞內(nèi)Rb2/P130水平基本相當(dāng)，但SKOV3中的Rb2/P130處于過度磷酸化狀態(tài)；經(jīng)ATRA處理后，CAOV3中低磷酸化Rb2/P130含量升高，而SKOV3中并無明顯變化。據(jù)此推測，Rb2/P130的過度磷酸化可能是其功能活性減弱和SKOV3抗ATRA治療的原因之一。

除G1/G0期異常外，端粒酶的活化也在細(xì)胞癌變的過程中起到關(guān)鍵作用。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(Telomerase Reverse Transcriptase,TERT)是控制端粒酶活化的主要基因，其編碼的端粒酶催化亞基可在多達(dá)95%的惡性腫瘤中使端粒延長，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)癌細(xì)胞的無限增殖。在EOC中，ATRA可以通過降低TERT基因的表達(dá)量來抑制端粒酶的活化，但這種機(jī)制并不普遍存在于所有EOC細(xì)胞系中，根據(jù)Losi等[15]研究顯示，只有當(dāng)TERT啟動(dòng)子基因處于低甲基化狀態(tài)時(shí)，ATRA才能成功地誘導(dǎo)TERT阻遏物與TERT啟動(dòng)子結(jié)合，抑制TERT基因表達(dá)。而在臨床中，約三分之一的上皮性卵巢癌患者具有低甲基化TERT啟動(dòng)子基因[16]。上述研究提示，TERT啟動(dòng)子的甲基化程度有望作為臨床上ATRA療效的預(yù)判指標(biāo)之一。

2 ATRA促進(jìn)EOC分化的分子通路

分化異常是癌細(xì)胞重要的生物學(xué)特性之一。與對(duì)照組相比，ATRA處理后的EOC細(xì)胞表面微絨毛明顯增多,胞漿內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和糖原顆粒增加, 細(xì)胞核異染色質(zhì)增加,呈現(xiàn)明顯分化趨勢[17-18]。除了形態(tài)學(xué)觀察外，生化指標(biāo)也顯示出，施加ATRA后，EOC細(xì)胞系3AO中堿性磷酸酶顯著上升；細(xì)胞系SKOV3內(nèi)分化相關(guān)NDRG1基因表達(dá)量增多；ATRA敏感株OVCAR3和CAOV3胞內(nèi)的黏蛋白含量明顯升高[19]，這些卵巢上皮分化標(biāo)志物的增加均表明EOC在ATRA的治療下向高分化方向發(fā)展。

ATRA的促分化效果受多種因素影響。Guruswamy等[19]用1μM ATRA處理SKOV3細(xì)胞系時(shí)發(fā)現(xiàn)其無明顯變化，但當(dāng)Caliaro等[20]用10 μM ATRA進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，SKOV3出現(xiàn)了25%的增殖抑制和一定的分化現(xiàn)象；同樣地，在ATRA敏感細(xì)胞系如CAOV3、OVCAR3中也出現(xiàn)了明顯的濃度依賴關(guān)系，10 μM ATRA處理下的分化標(biāo)志物檢測量幾乎是0.1 μM ATRA處理下的2倍[20]，說明ATRA促分化效果與給藥濃度有關(guān)。其次，細(xì)胞系的組織學(xué)來源也影響著分化治療效果。等量ATRA處理下，漿液性EOC細(xì)胞系NIHOVCAR3、OVCCR1的分化程度相似且均顯著高于子宮內(nèi)膜樣EOC細(xì)胞系IGROV1、SKOV3。此外，當(dāng)研究人員從SKOV3細(xì)胞系中分離出四種克隆能力不同的子細(xì)胞系后，發(fā)現(xiàn)其ATRA分化治療敏感性與克隆增殖能力成反比[20]，說明ATRA促分化效果也與細(xì)胞系的分化程度有關(guān)。

盡管目前尚無ATRA促進(jìn)EOC分化機(jī)制的報(bào)道，但大量研究提示，癌細(xì)胞內(nèi)RARα是ATRA促分化通路的關(guān)鍵物質(zhì)。在APL細(xì)胞系HL-60中，ATRA可以通過受體RARα直接或間接的介導(dǎo)作用，降低轉(zhuǎn)化生長因子對(duì)Smad家族蛋白2/3的磷酸化水平而誘導(dǎo)分化；在骨肉瘤細(xì)胞U2OS中，ATRA下調(diào)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶活化激酶(CDK activating kinase,CAK)對(duì)RARα的ser77位點(diǎn)的磷酸化程度，增加纖維母細(xì)胞生長因子8f的表達(dá)量，從而介導(dǎo)癌細(xì)胞分化[21]；類似地，ATRA還可以引起HL-60中CAK的MAT1泛素化，從而下調(diào)CAK對(duì)RARα的磷酸化水平；在老年急性髓樣白血病癌細(xì)胞中，用P38抑制劑阻礙RARα上S369的磷酸化或用GSK3抑制劑下調(diào)RARα中F域S449的磷酸化水平，均發(fā)現(xiàn)ATRA誘導(dǎo)分化能力提高[22]，目前，基于RARα轉(zhuǎn)錄后修飾的藥物聯(lián)合療法已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段[23]。盡管目前尚無針對(duì)EOC的類似實(shí)驗(yàn)，但以上研究提示，RARα修飾靶向藥有望在EOC中拓寬ATRA誘導(dǎo)分化治療的適用范圍并進(jìn)一步提升其療效。

3 ATRA促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子通路

選擇性誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡已成為近年來腫瘤治療的重要策略之一。大量研究顯示，ATRA是誘導(dǎo)EOC凋亡的有效藥物。在形態(tài)學(xué)上，EOC經(jīng)ATRA誘導(dǎo)后，細(xì)胞變圓，表面微絨毛消失，核膜皺褶內(nèi)陷，核染色質(zhì)邊集，有凋亡小體形成；在生化檢測中，其DNA片段化斷裂程度增加，caspase4明顯升高，呈現(xiàn)出明顯的凋亡特征[24]。

ATRA對(duì)EOC的促凋亡效果主要是通過促凋亡基因P53、抗凋亡基因如腫瘤壞死因子家族(tumor necrosis factor,TNF)、Bcl-2家族三種機(jī)制實(shí)現(xiàn)的。ATRA低、中、高劑量組(2.5×10-6mol/L、5×10-6mol/L、7.5×10-6mol/L)中，中劑量組對(duì)P53蛋白表達(dá)的促進(jìn)作用最顯著，提示ATRA可以通過提高EOC內(nèi)P53蛋白表達(dá)量來促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[25]，但過高的ATRA藥物濃度并不意味著更好的治療效果。其次，在EOC細(xì)胞系OVCAR3和MDAH-2774中，ATRA可以在mRNA水平上提高TNFRs腫瘤壞死因子受體家族1A(tumor necrosis factor receptor superfamily 1A,TNFRSF1A)和TNFRSF1A相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TNFRSF1A-associated death domain protein,TRADD)的表達(dá)量。當(dāng)TNF-α與TNFRSF1A結(jié)合后，TNFRSF1A的死亡結(jié)構(gòu)域與TRADD的結(jié)合分子發(fā)生相互作用，促進(jìn)caspase4等基因表達(dá)，激活caspase3、caspase7[25]，引起caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)而誘發(fā)凋亡[24]。此外，ATRA可提高EOC中Bcl-2家族中促凋亡蛋白的含量，如BNIP3(Bcl-2/adenovirus E1B-19K interacting protein)，并降低Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的含量，如Bcl-2 L1, Bcl-2 L12, Bcl-2 L13[24-25]；同時(shí)，ATRA可在mRNA層面降低Bcl-2相關(guān)永生基因表達(dá)，從而削弱其對(duì)Bax和FasL/Fas介導(dǎo)凋亡途徑的抑制作用，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[24]。

ATRA促凋亡與促分化作用間可能存在聯(lián)系。在ATRA作用初期，EOC表現(xiàn)出向成熟分化的趨勢；但隨著時(shí)間推進(jìn)，癌細(xì)胞逐漸表現(xiàn)出凋亡的一系列形態(tài)學(xué)特征。由此推測，癌細(xì)胞在被誘導(dǎo)向終末階段分化后則將趨向死亡。因此凋亡很可能就是細(xì)胞被誘導(dǎo)分化成熟以后的死亡形式，是誘導(dǎo)分化的結(jié)局。

4 ATRA抑制腫瘤干細(xì)胞的分子通路

腫瘤干細(xì)胞(cancer stem cells,CSCs)是少數(shù)具有自我更新能力等干性特征的癌細(xì)胞，其破壞作用強(qiáng)、耐藥性極高，在治療過程中難以被清除。因此針對(duì)CSCs的靶向治療成為近年熱門研究領(lǐng)域之一。

ATRA對(duì)EOC干細(xì)胞有多種影響機(jī)制，研究較為透徹的是基于CSCs標(biāo)志物——醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase,ALDH)的調(diào)控機(jī)制[26]。一項(xiàng)對(duì)2210例卵巢癌患者的Meta分析顯示，ALDH高表達(dá)與患者的低生存率密切相關(guān)，其高表達(dá)或高活性會(huì)提高卵巢癌細(xì)胞成球能力、增殖能力等干細(xì)胞特性[27]，由此推測針對(duì)ALDH蛋白的靶向治療有望解決CSCs高耐藥性問題[28]。

ALDH有多種同工酶，其中ALDH1是ATRA的靶蛋白之一，在癌細(xì)胞干性調(diào)節(jié)和腫瘤形成中起到關(guān)鍵調(diào)控作用。值得一提的是，盡管ALDH是視黃醛轉(zhuǎn)化為維甲酸的催化劑，對(duì)ATRA的合成有著關(guān)鍵作用，但ATRA卻可以通過反式激活經(jīng)典基因途徑下調(diào)ALDH1的表達(dá)量[26]。Young等[29]研究表明，在EOC細(xì)胞系ES2和A2780中，ATRA通過減少CSCs內(nèi)ALDH1基因表達(dá)量，抑制ALDH1/FoxM1/Notch1通路，削弱CSCs自我更新能力，進(jìn)而抑制CSCs成球能力和腫瘤的形成與轉(zhuǎn)移。Kim等[30]在EOC細(xì)胞系A(chǔ)2780DR研究發(fā)現(xiàn)，ATRA可以減少CSCs內(nèi)ALDH1mRNA表達(dá)量從而降低ALDH1蛋白含量，削弱ALDH1對(duì)核因子E2的激活作用，抑制癌細(xì)胞干性特征。此外，Wnt/β-catenin通路也與ATRA/ALDH調(diào)控路徑有關(guān)。在卵巢癌細(xì)胞中，有研究發(fā)現(xiàn)阻遏巨噬細(xì)胞分泌的Wnt5b配體可以抑制Wnt/β-catenin通路的激活，從而降低CSCs或高ALDH表達(dá)癌細(xì)胞的比例[31-32]。

然而，ATRA/ALDH干細(xì)胞治療通路并非適用于所有EOC亞型[33]。首先，在ALDH低表達(dá)的癌細(xì)胞中，ATRA無上述治療效果[30]；其次，若正常組織中也呈現(xiàn)ALDH高表達(dá)(如胰腺或肝)，ATRA也無法通過抑制干細(xì)胞特性來抗癌[26]。因此，只有在CSCs或ALDH高表達(dá)的EOC細(xì)胞，且其同源正常組織呈現(xiàn)低ALDH表達(dá)時(shí)，ATRA/ALDH干細(xì)胞治療通路才可能奏效。

除ALDH通路外，ATRA也能通過表觀遺傳修飾來誘導(dǎo)CSCs分化，如在老年急性髓樣白血病、前列腺癌、乳腺癌等細(xì)胞系中，ATRA可以通過微小RNA和DNA甲基化來調(diào)控CSCs分化[34]，類似機(jī)制在EOC中尚待研究。

5 結(jié)語與展望

大量臨床前實(shí)驗(yàn)均表明，ATRA可以通過調(diào)節(jié)EOC增殖、分化、凋亡通路及干細(xì)胞特性有效地抑制腫瘤的生長。但在臨床中推進(jìn)ATRA對(duì)EOC的治療仍面臨著諸多挑戰(zhàn)。首先，EOC種類較多，發(fā)生發(fā)展機(jī)制各異，ATRA治療方案并非對(duì)所有亞型奏效。其次，ATRA可能會(huì)在EOC同源正常組織中產(chǎn)生毒性，限制ATRA對(duì)EOC的臨床治療。再次，ATRA作用廣泛，有可能導(dǎo)致一些全身性不良反應(yīng)，如影響骨骼發(fā)育、胎兒發(fā)育畸形、損傷皮膚黏膜等。使用ATRA聯(lián)合療法或改變ATRA給藥方式可以顯著提高抗癌療效、降低藥物不良副反應(yīng)并擴(kuò)大ATRA治療的適用范圍，已成為目前熱點(diǎn)的研究方向。綜上所述，要實(shí)現(xiàn)ATRA的臨床轉(zhuǎn)化，我們亟需找到可以預(yù)測ATRA治療有效性的生物學(xué)指標(biāo)、探索不良反應(yīng)發(fā)生的分子機(jī)制、尋找更加有效的給藥方式及聯(lián)合用藥模式。