LINC00205靶向miR-514a-3p/NF-κB對血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)功能的作用

張聞伯，高新梅，王 喆，和傳波，趙 強

0 引 言

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是臨床常見的一種心血管疾病，其發(fā)生率逐年上升，人主動脈血管平滑肌細(xì)胞增殖、遷移是動脈粥樣硬化等心血管疾病的病理基礎(chǔ)。目前AS發(fā)病機制尚未闡明，因此明確AS的確切發(fā)病機制并展開積極的防控措施具有重要的臨床價值[1-2]。長鏈非編碼RNA(LncRNA)在ox-LDL誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞中表達異常并可調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡[3]。LINC00205通過靶向miR-122-5p促進肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[4]。但LINC00205對血管緊張素II(angiotensin II, AngII)誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的影響尚未可知。靶基因預(yù)測顯示微小RNA-514a-3p(miR-514a-3p)與LINC00205存在結(jié)合位點，LncRNA LUCAT1通過調(diào)節(jié)miR-514a-3p/ULK1軸而促進非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥[5]，LINC00205 可以通過抑制肝細(xì)胞癌的miR-184 來調(diào)節(jié)環(huán)氧化物水解酶表達，為肝細(xì)胞癌治療提供方案[6]。已有研究表明miR-514a-3p通過調(diào)控細(xì)胞核因子κB(nuclear factor kappa gene binding，NF-κB)通路從而參與腫瘤發(fā)生過程，與 miR-514a-3p調(diào)控NF-κB抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)[7]。但LINC00205是否調(diào)控miR-514a-3p/NF-κB通路而參與AS發(fā)生過程尚未清楚。因此，本研究采用AngII誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞建立動脈粥樣硬化模型，分析LINC00205/miR-514a-3p/NF-κB分子軸在血管平滑肌組織中發(fā)揮的作用及機制，為后續(xù)臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑人主動脈血管平滑肌細(xì)胞HA-VSMC(美國ATCC細(xì)胞庫)，AngII(美國Millipore Corporation)，DMEM(美國Gibco)，Lipofectamine2000、Trizol試劑(購自USA，Thermo Fisher公司)，反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR試劑(購自北京天根生化公司)，si-con、si-LINC00205、miR-con、miR-514a-3p mimics、anti-miR-con、anti-miR-514a-3p(購自廣州銳博生物公司)，MTT試劑、凋亡檢測試劑(北京索萊寶)，Transwell小室(美國Corning)，兔抗人CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleaved-caspase-3抗體(美國Santa Cruz)，兔抗人p-p65、p-IкBα抗體(北京百奧萊博)，山羊抗兔IgG二抗(購自USA，Abcam)。

1.2細(xì)胞學(xué)實驗

1.2.1 實驗分組HA-VSMC細(xì)胞(1×105個/mL)接種于96孔板(100 μL/孔)，加入含10-5mmol/L AngII的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h[8]，為AngII組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為正常組。將si-con、si-LINC00205、miR-con、miR-514a-3p mimics、anti-miR-con、anti-miR-514a-3p及si-LINC00205與anti-miR-con、si-LINC00205與anti-miR-514a-3p轉(zhuǎn)染至HA-VSMC細(xì)胞后加入含10-5mmol/L AngII的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，分別為si-con組、si-LINC00205組、miR-con組、miR-514a-3p組、anti-miR-con組、anti-miR-514a-3p組、si-LINC00205+anti-miR-con組、si-LINC00205+anti-miR-514a-3p組。

1.2.2qRT-PCR法檢驗LINC00205與miR-514a-3p表達情況HA-VSMC細(xì)胞的總RNA使用Trizol法獲得。反轉(zhuǎn)錄體系為：5×gDNA Buffer(2 μL)→10×King RT Buffer(2 μL)→FastKing RT Enzyme Mix(1 μL)→FQ-RT Primer Mix(2 μL)→RNA(2 μg)→補足RNase-Free ddH2O(需達到20 μL)。反應(yīng)體系具體配置方法和反應(yīng)程序均參考說明書進行，LINC00205與miR-514a-3p的表達情況通過羅氏LightCycler480熒光定量PCR儀獲得，具體操作流程參考說明書進行。

1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖各組HA-VSMC細(xì)胞(1×105個/mL)接種于96孔板(100 μL/孔)后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT溶液(20 μL/孔)后室溫孵育4 h，剔除上部清液后，每孔滴入150 μL DMSO，常溫靜置5 min，使用酶標(biāo)儀檢驗吸光度值，即A值。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率取各組HA-VSMC細(xì)胞加入預(yù)冷PBS，清洗完成后剔除上部清液，滴入結(jié)合緩沖液，用量為500 μL。然后在懸浮細(xì)胞中分別加入Annexin V-FITC和PI，用量均為5 μL，常溫靜置10 min檢驗細(xì)胞凋亡率，檢驗設(shè)備為FACS Calibur流式細(xì)胞儀。

1.2.5Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移將各組HA-VSMC細(xì)胞懸液(2×104個/mL)加入小室的上室(200 μL/孔)，在下室中置入培養(yǎng)液(用量為600 μL)后放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為24 h，培養(yǎng)結(jié)束后使用甲醛固定，靜置20 min，使用結(jié)晶紫染液(濃度為0.1%)染色，靜置10 min后通過顯微鏡查看遷移細(xì)胞數(shù)并記錄。

1.2.6LINC00205與miR-514a-3p間靶向關(guān)系的檢驗經(jīng)Starbase檢驗證明LINC00205和miR-514a-3p有結(jié)合位點，建立突變型載體(MUT-LINC00205)和野生型載體(WT-LINC00205)，然后與miR-con、miR-514a-3p mimics同時轉(zhuǎn)染到HA-VSMC細(xì)胞中，常溫培養(yǎng)24 h，觀察看熒光素酶活性。

1.2.7CyclinD1、MMP2、MMP9、Cleaved-caspase-3、p-p65、p-IкBα、p65、IкBα各蛋白表達情況的檢驗將500 μL RIPA裂解液滴入HA-VSMC細(xì)胞中，獲得細(xì)胞總蛋白，經(jīng)BCA法察看蛋白濃度后分離蛋白，然后轉(zhuǎn)膜并封閉2 h，封閉完成后加入比例為1∶2000的一抗稀釋液和二抗稀釋液，常溫靜置60 min，檢驗條帶灰度值，檢驗軟件為ImageJ。

1.3動物學(xué)實驗

1.3.1 實驗動物及分組將健康級大鼠20只(購自濟南朋悅試驗動物繁殖有限公司)，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(魯)2014-0007，雌雄各半，隨機分為對照組和AS組，每組10只。其中對照組給予普通飼料喂養(yǎng)，AS組給予含有蛋氨酸2%的飼料喂養(yǎng)，持續(xù)喂養(yǎng)4周，建立AS模型。動物試驗全過程均符合動物3R原則。實驗室飼養(yǎng)環(huán)境：清潔環(huán)境，相對濕度50%～70%，室溫22～26 ℃，白晝交替，自由攝食飲水。

1.3.2頸動脈內(nèi)膜中膜厚度安樂處死大鼠，切開頸部，取左側(cè)頸動脈，采用液氮研磨，加入RIPA裂解液充分裂解，4 ℃ 10 000 r/min離心15 min，取上清，以BCA試劑盒測定蛋白純度。采用1.2.7方法檢測頸動脈LINC00205、miR-514a-3p、p-p65、p-IкBα、p65、IкBα蛋白的表達。

2 結(jié) 果

2.1 HA-VSMC細(xì)胞中LINC00205、miR-514a-3p的表達情況與正常組LINC00205蛋白、miR-514a-3p蛋白表達[(1.00±0.10)、(1.04±0.13)]比較，AngII組[(2.69±0.24)、(0.21±0.05)]明顯升高(P<0.05)。

2.2低表達LINC00205對HA-VSMC細(xì)胞增殖的影響與正常組比較，AngII組A值明顯升高[(1.01±0.10)vs(1.46±0.12),P<0.05]；與si-con組比較，si-LINC00205組A值降低[(1.48±0.13)vs(1.08±0.09),P<0.05]。

2.3低表達LINC00205對HA-VSMC細(xì)胞凋亡的影響與正常組凋亡率比較，AngII組明顯降低(P<0.05)；與si-con組凋亡率比較，si-LINC00205組明顯升高(P<0.05)。見圖1。

圖 1 低表達LINC00205對HA-VSMC細(xì)胞凋亡的影響

2.4低表達LINC00205對HA-VSMC細(xì)胞遷移的影響與正常組HA-VSMC細(xì)胞遷移數(shù)比較，AngII組明顯升高[(67±6)vs(153±14),P<0.05]；與si-con組HA-VSMC細(xì)胞遷移數(shù)比較，si-LINC00205組明顯降低[(158±15)vs(72±7),P<0.05]。

2.5低表達LINC00205對HA-VSMC細(xì)胞CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達的影響與正常組比較，AngII組CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平明顯升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與si-con組比較，si-LINC00205組CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平明顯降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖2，表1。

1:正常組; 2:AngII組; 3:si-con組; 4:si-LINC00205組

表 1 低表達LINC00205對HA-VSMC細(xì)胞各蛋白表達的影響

2.6高表達miR-514a-3p對HA-VSMC細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響與miR-con組比較，miR-514a-3p組A值、遷移數(shù)、CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平明顯降低(P<0.05)，凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖3，表2。

1:miR-con組; 2:miR-514a-3p組

表 2 高表達miR-514a-3p對HA-VSMC細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響

2.7LINC00205靶向miR-514a-3p如圖4顯示，Starbase預(yù)測檢驗后LINC00205和miR-514a-3p有結(jié)合位點。與miR-con組WT-LINC00205表達(1.00±0.12)比較，miR-514a-3p組(0.48±0.08)明顯降低(P<0.05)；MUT-WT-LINC00205表達(1.02±0.19)與miR-514a-3p組(1.01±0.17)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。pcDNA-LINC00205組miR-514a-3p蛋白的表達(0.47±0.03)明顯低于pcDNA-con組(1.01±0.10)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與si-con組miR-514a-3p的表達水平(1.02±0.09)比較，si-LINC00205組(1.75±0.21)明顯升高(P<0.05)。

圖 4 Starbase預(yù)測LINC00205和miR-514a-3p的結(jié)合位點

2.8低表達miR-514a-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC00205低表達對HA-VSMC增殖、凋亡及遷移的影響與anti-miR-con組比較，anti-miR-514a-3p組A值升高[(1.46±0.12)vs(1.83±0.17),P<0.05]，與si-LINC00205+anti-miR-con組比較，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p組A值升高[(1.08±0.08)vs(1.51±0.13),P<0.05]；與anti-miR-con組比較，anti-miR-514a-3p組凋亡率降低[(4.41±0.42)vs(0.35±0.03),P<0.05]，與si-LINC00205+anti-miR-con組比較，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p組凋亡率降低[(14.02±1.35)vs(6.51±0.63),P<0.05]。與anti-miR-con組比較，anti-miR-514a-3p組遷移數(shù)增多[(163±14)vs(213±20),P<0.05]；與si-LINC00205+anti-miR-con組比較，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p組遷移數(shù)增多[(76±7)vs(179±16),P<0.05]。

2.9低表達miR-514a-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC00205低表達對HA-VSMCCyclinD1、Cleaved-caspase-3、caspase-3、MMP2、MMP9蛋白表達的影響與anti-miR-con組比較，anti-miR-514a-3p組CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)；與si-LINC00205+anti-miR-con組比較，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p組CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白水平降低(P<0.05)。見圖5，表3。

1:anti-miR-con組; 2:anti-miR-514a-3p組; 3:si-LINC00205+anti-miR-con組; 4:si-LINC00205+anti-miR-514a-3p組

表 3 低表達miR-514a-3p可以逆轉(zhuǎn)LINC00205低表達對HA-VSMC增殖、凋亡和遷移的影響

2.10Western blot檢測NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達與正常組比較，AngII組p-p65、p-IкBα蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與anti-miR-con組比較，anti-miR-514a-3p組p-p65、p-IкBα蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與si-NC組比較，si-LINC00205組p-p65、p-IкBα蛋白水平明顯降低(P<0.05)；與si-LINC00205+anti-miR-con組比較，si-LINC00205+anti-miR-514a-3p組p-p65、p-IкBα蛋白水平明顯升高(P<0.05)。見圖6，表4。

2.11Western blot檢測動脈粥樣硬化大鼠NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達與對照組比較，AS組LINC00205、p-p65、p-IкBα蛋白水平明顯升高(P<0.05)，miR-514a-3p蛋白水平明顯降低(P<0.05)。見表5，圖7。

1:正常組; 2:AngII組; 3:anti-miR-con組; 4:anti-miR-514a-3p組; 5:si-con組; 6:si-LINC00205組; 7:si-LINC00205+anti-miR-con組; 8:si-LINC00205+anti-miR-514a-3p組

表 4 NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達

表 5 動脈粥樣硬化大鼠NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達

1:對照組; 2:AS組

3 討 論

研究表明，在AS患者發(fā)病及惡化過程中，LncRNA起重要介導(dǎo)作用[9-10]，典型例子為LncRNA 430945能夠有效介導(dǎo)AS患者血管平滑肌細(xì)胞的繁殖與遷移[11]。LncRNA LEF1-AS1通過靶向miR-544a/PTEN軸而調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖[12]。LncRNA MEG8通過靶向PPARα調(diào)節(jié)血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡[13]。但LINC00205在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中的作用機制尚未闡明。

本研究結(jié)果顯示，AngII誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞中LINC00205的表達水平升高，關(guān)于LINC00205在動脈粥樣硬化中的表達及其可能作用機等尚未見報道。已有研究表明LINC00205在肝細(xì)胞癌、肺癌、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤等腫瘤中表達水平升高，并可促進腫瘤的發(fā)生及發(fā)展[14-16]。表明LINC00205在動脈粥樣硬化發(fā)生過程中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究進一步研究顯示AngII誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞增殖能力及遷移能力明顯增強，而細(xì)胞凋亡率明顯降低，并可促進CyclinD1、MMP2、MMP9表達及抑制Cleaved-caspase-3表達，這結(jié)果與相關(guān)文獻報道相似[17-19]，提示成功建立動脈粥樣硬化模型。體外細(xì)胞實驗中采用AngII誘導(dǎo)HA-VSMC細(xì)胞，抑制LINC00205表達后可明顯降低細(xì)胞增殖及遷移能力，并可提高細(xì)胞凋亡率，提示抑制LINC00205表達可抑制AngII誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞增殖及遷移，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

本研究證實LINC00205可充當(dāng)miR-514a-3p的競爭性內(nèi)源RNA。miR-514a-3p在腎細(xì)胞癌中起著抑癌作用[20]。在本研究中，miR-514a-3p蛋白在AngII介導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞中呈明顯的低表達趨勢，而深入研究結(jié)果表明miR-514a-3p過表達可明顯降低AngII誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞活力及減少遷移細(xì)胞數(shù)，并可促進細(xì)胞凋亡，而抑制miR-514a-3p表達可明顯逆轉(zhuǎn)上述作用，提示miR-514a-3p過表達可抑制AngII誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞增殖及遷移，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外，本研究中還發(fā)現(xiàn)同時降低LINC00205蛋白和miR-514a-3p蛋白表達，不僅能夠大大提高AngII介導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞的繁殖和遷徙能力，還能夠大大提高細(xì)胞總成活率，提示抑制miR-514a-3p表達可明顯逆轉(zhuǎn)抑制LINC00205表達對AngII誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的作用。金雀異黃素通過抑制ER-p38/ERK1/2-PPARγ-NF-κB信號通路而抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞遷移[21]。p-p65、p-IкBα是NF-κB信號通路的主要蛋白，通過抑制NF-κB信號通路的活化可明顯抑制AngII誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移[22]。本研究結(jié)果顯示，AngII誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞中p-p65、p-IкBα的表達水平升高，而抑制LINC00205表達后可明顯降低p-p65、p-IкBα的表達水平，抑制miR-514a-3p表達可明顯逆轉(zhuǎn)抑制LINC00205表達對NF-κB信號通路的作用，提示抑制LINC00205表達可通過調(diào)控miR-514a-3p/NF-κB通路而發(fā)揮作用，動脈粥樣硬化大鼠的在體研究也證實了上述細(xì)胞學(xué)研究結(jié)論。

另外，從信號通道層面，參與動脈粥樣硬化還包括酪氨酸蛋白激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子(JAK/STAT)及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)，兩者均與脂質(zhì)沉積和炎性浸潤的調(diào)控相關(guān)。長鏈非編碼RNA與上述信號通道在動脈粥樣硬化或代謝性疾病的發(fā)生發(fā)展也有相關(guān)報道，如Yao等[23]報道Lnc00113 通過激活 PI3K/Akt 信號通路促進細(xì)胞增殖、存活和遷移，可作為動脈粥樣硬化的潛在治療靶點。Han等[24]研究認(rèn)為LncRNA H19 通過調(diào)節(jié) JAK/STAT 通路促進海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞活化，并可能成為預(yù)防癲癇的治療手段。那么是否存在LINC00205與上述經(jīng)典動脈粥樣硬化信號通道存在調(diào)節(jié)關(guān)系，仍有必要進一步研究探討。

綜上所述，在AngII誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞中，LINC00205蛋白高表達，miR-514a-3p蛋白則低表達，降低LINC00205蛋白的表達，會經(jīng)增加miR-514a-3p蛋白表達而抑制AngII誘導(dǎo)的HA-VSMC細(xì)胞增殖及遷移，同時增加細(xì)胞凋亡率，NF-κB信號通路活性下降是導(dǎo)致該情況的主要原因，這可以作為早期診斷AS的靶向指標(biāo)，對后續(xù)從分子層面分析AS患者發(fā)病機制的研究具有重要指導(dǎo)意義。