CYLD基因?qū)ι窠?jīng)母細胞瘤凋亡和活性氧水平及NF-κB信號的影響

孫家棟，李雪梅，劉君玲

0 引 言

神經(jīng)母細胞瘤(neuroblastoma，NB)是兒童最為常見的惡性實體腫瘤，具有高發(fā)病率、高病死率、預后差等特點，近些年基因治療、免疫生物治療等成為研究熱點[1]。腫瘤抑制因子圓柱瘤基因(cylindroma，CYLD)基因是2003年在Nature雜志報道的腫瘤抑制基因，在人體內(nèi)廣泛存在，作為一個去泛素化酶，可通過抑制JNK、NF-κB、Wnt/β-catenin等信號通路激活，從而在細胞周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生抑制等事件中發(fā)揮重要作用[2-3]。近些年研究表明，CYLD與多種實體腫瘤發(fā)生密切相關[4-5]。CYLD在神經(jīng)母細胞瘤研究極少，有研究發(fā)現(xiàn)，在神經(jīng)母細胞瘤患者CYLD高表達，與總生存期延長、預后較好有關，且與分期呈現(xiàn)負相關[6]。CYLD對神經(jīng)母細胞瘤細胞生物學特性及機制研究尚未清楚。因此，本研究以人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y為模型，將pcDNA3.1-CYLD質(zhì)粒轉染SH-SY5Y細胞，觀察細胞活力、凋亡率情況，并進一步研究其對ROS及NF-κB信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、FBS均購自美國Gibco；CYLD抗體、p52抗體、cyclinD1抗體和Bax抗體均購自美國CST；ROS檢測試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒均購自碧云天生物技術研究所；MTT購自美國Sigma；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒購自南京凱基；酶標儀購自美國BioTek；流式細胞儀購自美國BD。

1.2細胞培養(yǎng)人神經(jīng)母細胞瘤細胞系SH-SY5Y購自中國科學院上海細胞庫。細胞常規(guī)復蘇后用在胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2 d換1次培養(yǎng)液，細胞長滿培養(yǎng)瓶壁即可傳代。

1.3分組及轉染將SH-SY5Y細胞分為3組，即空白組、pcDNA3.1組(轉染空白pcDNA3.1質(zhì)粒)和pcDNA3.1-CYLD組(轉染pcDNA3.1-CYLD質(zhì)粒)。其中pcDNA3.1-CYLD質(zhì)粒及空白pcDNA3.1質(zhì)粒均由上海吉瑪完成。參照LipofectamineTM2000說明進行轉染，簡要步驟如下：含15% FBS、不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基將SH-SY5Y細胞以1.5×105/mL接種至24孔板，次日，將制備的質(zhì)粒-Lipofectamine混合液緩慢加至孔內(nèi)，每孔100 μL，前后搖動孔板，混勻后放入孵箱，48 h后，收集細胞，用于后續(xù)實驗。

1.4Western blot檢測CYLD、p52、cyclinD1和Bax蛋白表達pcDNA3.1-CYLD轉染SH-SY5Y細胞48 h，適量的RIPA細胞裂解液提取細胞總蛋白，蛋白經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定后，每孔上樣40 μg蛋白，經(jīng)15% SDS-PAGE分離，電泳后電轉PVDF膜，50 g/L的脫脂奶粉封閉膜2 h，洗膜，4 ℃孵育一抗(CYLD、p52、cyclinD1和Bax抗體，稀釋比例均為1∶500)過夜，TBST洗膜，加HRP標記的二抗(稀釋比例1∶2000)，室溫孵育1.5 h，TBST洗膜，暗處配置顯影液，把膠片放入Bio-RadChemiDocXRS+化學發(fā)光成像系統(tǒng)，每膠片加300 μL顯影液，顯影后拷貝照片，使用Quantity One軟件分析圖像。以檢測的目的蛋白與內(nèi)參GAPDH灰度值比值為各蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.5MTT法檢測細胞活力收集 1.3 方法處理的各組細胞，以 4 × 103個/孔接種于 96 孔板，每孔 100 μL 培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，待細胞生長貼壁后，每組設置5個平行孔，37 ℃培養(yǎng)24、48、72和96 h，加MTT(5 mg/mL)溶液，每孔20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加DMSO，每孔100 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)15 min，使結晶紫能充分溶解。96孔板置于酶標儀中，在490 nm波長測定各孔的吸光度值(A)。實驗重復3次。

1.6流式細胞儀實驗檢測細胞凋亡率胰蛋白酶消化轉染pcDNA3.1-CYLD 48 h的細胞，制備成細胞懸液，預冷PBS洗滌細胞，離心，去上清，細胞沉淀中加入Annexin-binding Buffer重懸細胞，細胞懸液中加5 μL的Annexin V-FITC和10 μL的PI，室溫放于暗處反應15 min，使用流式細胞儀檢測。實驗重復3次。

1.7ROS檢測采用活性氧檢測試劑盒檢測細胞內(nèi)的ROS水平。PBS洗滌轉染pcDNA3.1-CYLD 48 h的細胞，離心，去上清，加1 μL(10 mmol/L)熒光探針CM-H2DCFDA，使其終濃度為10 μmmol/L，37 ℃溫箱孵育30 min，每隔3 min顛倒混勻1次，使用流式細胞儀檢測。檢測時使用488 nm激發(fā)波長和525 nm發(fā)射波長。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 CYLD在神經(jīng)母細胞細胞中的表達Western blot結果顯示，空白組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-CYLD組的蛋白表達分別為(0.074±0.010)、(0.089±0.012)和(0.787±0.067)；pcDNA3.1-CYLD組CYLD表達明顯高于pcDNA3.1組(P<0.05)，見圖1。

1:空白組; 2:pcDNA3.1組; 3:pcDNA3.1-CYLD組

2.2上調(diào)CYLD表達可抑制SH-SY5Y細胞活力SH-SY5Y細胞轉染pcDNA3.1-CYLD質(zhì)粒 24、48、72和96 h，pcDNA3.1-CYLD組細胞活力(48、72和96 h)明顯低于pcDNA3.1組(P<0.05)。見圖2。

與pcDNA3.1組比較，*P<0.05

2.3上調(diào)CYLD表達可促進SH-SY5Y細胞凋亡pcDNA3.1-CYLD質(zhì)粒轉染SH-SY5Y細胞，空白組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-CYLD組的細胞凋亡率分別為(4.41%±0.47%)、(4.23%±0.41%)和(21.36%±0.79%)；pcDNA3.1-CYLD組細胞凋亡率明顯高于pcDNA3.1組(P<0.05)。見圖3。

2.4上調(diào)CYLD表達可誘導SH-SY5Y細胞ROS產(chǎn)生結果顯示，空白組、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-CYLD組的ROS熒光強度分別為(64.74±1.02)、(66.51±1.26)和(94.39±1.58)；pcDNA3.1-CYLD組ROS熒光強度明顯高于pcDNA3.1組(P<0.05)。

2.5上調(diào)CYLD表達可下調(diào)SH-SY5Y細胞NF-κB信號通路Western blot檢測結果顯示，與pcDNA3.1組比較，pcDNA3.1-CYLD組p52和cyclinD1蛋白表達明顯降低(P<0.05)，Bax蛋白表達明顯升高(P<0.05)，見圖4，表1。

a:空白組; b:pcDNA3.1組; c:pcDNA3.1-CYLD組

1:空白組; 2:pcDNA3.1組; 3:pcDNA3.1-CYLD組

表 1 p52、cyclinD1和Bax的蛋白相對表達量

3 討 論

CYLD蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制因子，可去泛素化p53、Bcl-3、TRAFs等信號分子，作用于JNK、NF-κB等多條信號通路，在多種實體腫瘤信號激活中起重要的調(diào)節(jié)作用[7-8]。研究表明，下調(diào)CYLD表達可增強人乳腺癌細胞生長和遷移能力[9]。miR-181b可通過上調(diào)CYLD表達誘導甲狀腺癌細胞凋亡[10]。以上研究提示CYLD可以作為多種細胞瘤的生物標志物。本研究結果顯示，上調(diào)CYLD表達可抑制神經(jīng)母細胞瘤活力，誘導細胞凋亡，這與上述研究結果相似，提示CYLD可能是神經(jīng)母細胞瘤分子治療的一個有效靶點。

氧化應激是細胞內(nèi)由于ROS產(chǎn)生過量引起的一種氧化-抗氧化體系失衡的應激損傷狀態(tài)。ROS是一類有氧化還原潛能的氧衍生物，具有潛在的危險的細胞代謝副產(chǎn)物，可直接對細胞生長、衰老、癌癥發(fā)展等產(chǎn)生影響[11-12]。有研究表明，過量ROS產(chǎn)生能對細胞DNA、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)膜等各種重要成分造成損傷，進而導致腫瘤細胞凋亡[13]。近些年的大量研究表明，ROS可誘導肝癌、食管癌、神經(jīng)母細胞瘤等多種腫瘤細胞凋亡[14-16]。本研究結果顯示，上調(diào)CYLD表達可誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞ROS產(chǎn)生，提示誘導ROS產(chǎn)生可能是上調(diào)CYLD表達促進神經(jīng)母細胞瘤凋亡的機制之一。

NF-κB信號是膜受體介導的信號轉導途徑之一，參與機體炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)、增殖、凋亡等生物學過程。在多種腫瘤(包括神經(jīng)母細胞瘤)中可以被激活，參與腫瘤細胞的發(fā)生發(fā)展[17]。有研究報道，CYLD可以作為去泛素化酶可負性調(diào)節(jié)NF-κB信號通路[18]。CYLD基因缺失時，可誘發(fā)Bcl-3泛素化，使其在細胞核內(nèi)聚集，且與NF-κB家族p52或p50結合，激活cyclinD1基因轉錄和表達，從而誘發(fā)腫瘤發(fā)生[19]。有研究表明，CYLD通過抑制NF-κB信號通路抑制了胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡[20]。過表達CYLD可通過抑制肺癌細胞NF-κB信號增強TRAIL的抗腫瘤活性[21]。本研究結果顯示，上調(diào)CYLD表達可抑制p52和cyclinD1表達，上調(diào)Bax表達。

綜上所述，上調(diào)CYLD表達可誘導神經(jīng)母細胞瘤細胞凋亡，機制可能與提高細胞ROS水平及抑制NF-κB信號通路有關。目前關于CYLD在神經(jīng)母細胞瘤中的研究較少，值得進一步深入探究。