PDK1、IL12RB1和TCL1A基因多態(tài)性與西藏世居人群高原紅細(xì)胞增多癥易感性分析

陳 輝，楊雪林，張致英，張 寒，馬福才，渠敬鋒，普 赤，劉麗軍，康龍麗

0 引 言

高原紅細(xì)胞增多癥(high altitude polycythemia, HAPC)是人類在長(zhǎng)期處于高于2500米高海拔環(huán)境中，由高原低氧引起的紅細(xì)胞代償性過(guò)度增生，導(dǎo)致血液黏稠度升高、血流阻力增加的一種慢性高原疾病[1]。細(xì)胞內(nèi)氧含量的差異會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生從而引起相應(yīng)癥狀[2]。HAPC會(huì)侵犯皮膚黏膜，導(dǎo)致患者口唇、兩頰、鼻尖、耳垂、手掌、指甲等多部位出現(xiàn)皮膚黏膜青紫，呈“多血貌”征[3]；當(dāng)累及心血管、呼吸、神經(jīng)等多個(gè)系統(tǒng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)頭痛、心悸、呼吸困難、失眠等多種癥狀[4-5]，嚴(yán)重危害世居西藏人群身體健康。高海拔人群之間適應(yīng)模式存在一定差異，表明在一定程度上，這種適應(yīng)存在不同的遺傳機(jī)制。PENG等[6]描述了參與HIF途徑的EPAS1和EGLN1基因可能是高海拔遺傳適應(yīng)的候選基因。FAN等[7]通過(guò)全外顯子測(cè)序，發(fā)現(xiàn)在西藏世居人群中PIK3CD和COL4A3基因上存在差異SNP位點(diǎn)。ZHOU等[8]通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)研究，發(fā)現(xiàn)紅細(xì)胞生成調(diào)節(jié)基因SENP1和癌基因ANP32D在患有慢性高原疾病的患者中表達(dá)上調(diào)。在不同人群中，HAPC疾病的候選基因不一定相同，連鎖不平衡分析結(jié)果在不同人群中的表現(xiàn)也不一定相同。本研究前期發(fā)現(xiàn)西藏世居人群中存在可能的HAPC易感基因PDK1、IL12RB1和TCL1A。因此，本研究旨在通過(guò)靶向測(cè)序探尋PDK1、IL12RB1和TCL1A基因多態(tài)性與西藏世居人群HAPC的易感性關(guān)系，從而為西藏世居人群HAPC發(fā)病機(jī)制研究提供依據(jù)，探尋HAPC發(fā)生的危險(xiǎn)因素。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象回顧性收集2016年9月至2018年9月西藏民族大學(xué)附屬醫(yī)院和西藏自治區(qū)第二人民醫(yī)院高原病及心血管內(nèi)科和檢驗(yàn)科567例就診的HAPC患者為HAPC組，其中男455例，女112例。納入標(biāo)準(zhǔn)：長(zhǎng)期居住于海拔高于3650米的青藏高原西藏世居人群；為三代以內(nèi)無(wú)血緣關(guān)系的獨(dú)立個(gè)體；所有患者符合“青海標(biāo)準(zhǔn)”[1]；由兩名副高及以上臨床醫(yī)師進(jìn)行確診；男Hb≥21 g/dL，女Hb≥19 g/dL。排除標(biāo)準(zhǔn)：慢性病導(dǎo)致繼發(fā)性紅細(xì)胞增多患者。同時(shí)選取360例健康體檢人員作為對(duì)照組，其中男248例，女112例。本研究獲得西藏民族大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：201801)，所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2提取DNA采集研究對(duì)象靜脈血液樣本2～3 mL，置于含有乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中，使用TIANamp血液基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，中國(guó)北京)從外周血中提取適合測(cè)序的高質(zhì)量基因組DNA。測(cè)定提取的DNA濃度、純度及質(zhì)量，合格樣本置于-20 ℃冰箱中保存。

1.3靶向測(cè)序及基因分型選擇PDK1、IL12RB1和TCL1A的蛋白質(zhì)編碼序列，優(yōu)化多重 PCR panel 中的引物組成及濃度，以 2×150 bp 的雙端測(cè)序模式在Illumina Hiseq(Illumina, CA, USA)平臺(tái)進(jìn)行高通量靶向測(cè)序。測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量由FastQC確定，每個(gè)樣品的平均覆蓋深度至少是200X，堿基Q30比例>94%。對(duì)所有HAPC組和對(duì)照組中PDK1、IL12RB1和TCL1A基因 SNP進(jìn)行基因分型。在HAPC組和對(duì)照組中，與HAPC顯著相關(guān)的基因型變異被分型。5%重復(fù)樣本的符合率在99%以上。

1.4生物信息學(xué)分析采用病例對(duì)照研究方法，評(píng)價(jià)西藏世居人群PDK1、IL12RB1和TCL1A基因與HAPC的關(guān)系。篩選SNP的標(biāo)準(zhǔn)為最小等位基因頻率(minor allele frequency, MAF)≥0.05。用Plink進(jìn)行遺傳關(guān)聯(lián)分析和比值比(OR)計(jì)算，基因型位點(diǎn)多態(tài)性與疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)性用OR及其95%可信區(qū)間(95%CI)表示。采用顯性模型、隱性模型和加性模型3種遺傳模型對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行Logistic回歸分析。并對(duì)每個(gè)基因位點(diǎn)使用 Haploviewv4.2軟件進(jìn)行連鎖不平衡分析，從而獲得存在較強(qiáng)關(guān)聯(lián)性的單倍型。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 23.0及R 3.6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)處理。HAPC組和對(duì)照組之間等位基因和基因型頻率的Hardy-Weinberg平衡(HWE)，用標(biāo)準(zhǔn)擬合優(yōu)度的χ2檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。Fisher′s精確檢驗(yàn)分析兩組間等位基因分布的差異。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1PDK1、IL12RB1和TCL1A基因SNP位點(diǎn)的Hardy-Weinberg檢驗(yàn)所有樣本共檢測(cè)出突變位點(diǎn)32個(gè)，歸納各突變位點(diǎn)的基因富集區(qū)，包括內(nèi)含子區(qū)(intronic)、外顯子區(qū)(exonic)、3′-UTR、剪切位點(diǎn)區(qū)(splicing)、基因上游區(qū)(upstream)、基因下游區(qū)(downstream)、基因間區(qū)(intergenic)突變等。2組MAF值均≥0.05，故所有SNPs符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。說(shuō)明PDK1、IL12RB1和TCL1A基因共計(jì)32個(gè)位點(diǎn)與HAPC存在關(guān)聯(lián)，符合分型標(biāo)準(zhǔn)。其中PDK1基因存在8個(gè)SNPs，IL12RB1基因存在15個(gè)SNPs，TCL1A基因存在9個(gè)SNPs。

2.2差異SNP位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析對(duì)上述32個(gè)SNPs位點(diǎn)進(jìn)行分析顯示，PDK1和TCL1A基因的SNP位點(diǎn)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但I(xiàn)L12RB1基因的rs393548、rs436857及rs845380位點(diǎn)與HAPC有關(guān)(P<0.05)。進(jìn)一步對(duì)有關(guān)的3個(gè)SNPs進(jìn)一步分析，共篩選出3個(gè)SNPs位點(diǎn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：總體樣本存在IL12RB1基因SNPrs393548和rs436857，女性樣本中存在IL12RB1基因rs845380。在經(jīng)過(guò)FDR校正或Bonferroni校正后，上述SNP均不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表 1 Fisher′s精確檢驗(yàn)篩選出的3個(gè)SNPs基因型頻率統(tǒng)計(jì)

2.3差異SNP位點(diǎn)的遺傳模型分析根據(jù)性別狀況對(duì)IL12RB1基因rs393548、rs436857和 rs845380 進(jìn)行分層處理并結(jié)合遺傳模型分析?？傮w樣本水平，rs393548和rs436857在顯性模型和加性模型分析均與HAPC易感性增加有關(guān)(P<0.05)。在女性樣本水平，HAPC保護(hù)因素是SNP rs845380，在隱性模型和加性模型分析均與HAPC保護(hù)性增加有關(guān)(P<0.05)。在男性樣本水平，rs393548只在顯性模型中顯示出對(duì)HAPC的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表 2 3個(gè)SNPs在顯性模型、隱性模型和加性模型中的關(guān)聯(lián)結(jié)果

2.3PDK1、IL12RB1和TCL1A基因SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析與單倍型分析

2.3.1PDK1基因?qū)DK1基因的8個(gè)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡分析顯示，一個(gè)單倍型域由這8個(gè)SNPs共同組成。而在進(jìn)行單倍型分析后，HAPC組和對(duì)照組之間單倍型域的單倍型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表 3 PDK1基因單倍型頻率及其與HAPC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

2.3.2IL12RB1基因?qū)L12RB1基因的15個(gè)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡分析顯示出五個(gè)單倍型域，第1個(gè)由rs3833286和rs3746190組成，第2個(gè)由rs3746190, rs12461312, rs17882555和rs383483組成，第3個(gè)由rs401502, rs375947, rs845380, rs845381, rs17852635, rs11575934和rs11086087組成，第4個(gè)由rs436857和rs393548組成，第5個(gè)由rs393548和SNV00212組成。其余SNP在單倍型域之外。在進(jìn)行單倍型分析后，發(fā)現(xiàn)5個(gè)單倍型域中，第4個(gè)和第5個(gè)Block在HAPC組和對(duì)照組之間單倍型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余單倍型域的單倍型頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1，表4。

圖 1 IL12RB1基因SNPs之間的成對(duì)連鎖不平衡圖

表 4 IL12RB1基因單倍型頻率與HAPC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

2.3.3TCL1A基因?qū)CL1A基因的9個(gè)SNPs進(jìn)行連鎖不平衡分析，可以觀察到兩個(gè)單倍型域，Block1由rs17093294、rs79582761、rs77796335、rs150271502和rs11846938組成，Block2由rs150271502, rs11846938, rs2887399和rs139012944組成。另外2個(gè)SNPs在單倍型域之外，其單倍型頻率在HAPC組和對(duì)照組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表 5 TCL1A基因單倍型頻率及其與HAPC風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性

通過(guò)PDK1、IL12RB1和TCL1A基因共計(jì)32個(gè)SNPs位點(diǎn)的連鎖不平衡分析，并結(jié)合單倍型分析，顯示IL12RB1基因的SNP位點(diǎn)rs436857和rs393548，以及rs393548和SNV00212之間存在較高的連鎖不平衡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(D'>0.9)；IL12RB1基因構(gòu)建具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單倍型域中, A-A單倍型以及A--單倍型HAPC發(fā)病的危險(xiǎn)因素(P<0.05)。

3 討 論

課題組前期對(duì)生活在西藏海拔3650米地區(qū)的高原人群進(jìn)行全外顯子測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，PDK1、IL12RB1和TCL1A基因可能與高原人群的HAPC發(fā)生相關(guān)。本研究采取目標(biāo)基因靶向測(cè)序技術(shù)，分析西藏世居人群病例對(duì)照組之間基因多態(tài)性差異及其與HAPC易感性的關(guān)系。我們從567例HAPC患者和360例健康志愿者的血液樣本中篩選出IL12RB1基因上存在與HAPC相關(guān)的3個(gè)SNPs，其中rs393548和rs436857與西藏世居人群HAPC易感性增加有關(guān)，而rs845380是可能的保護(hù)性因素。此外，IL12RB1基因的SNP位點(diǎn)間構(gòu)成了可能是HAPC危險(xiǎn)因素的A-A單倍型和A--單倍型。而在本次實(shí)驗(yàn)中，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)PDK1和TCL1A基因多態(tài)性與西藏世居人群HAPC易感性的直接關(guān)系。

關(guān)鍵細(xì)胞因子基因的遺傳變異可能會(huì)導(dǎo)致免疫應(yīng)答失衡，從而影響人體的健康狀況。IL12RB1基因位于染色體19p13.1上，大小約為28 kb，是人類對(duì)抗細(xì)胞內(nèi)病原體產(chǎn)生抵抗力所介導(dǎo)的細(xì)胞因子的基因[9]。IL12RB1基因發(fā)生遺傳變異可能是通過(guò)降低對(duì)IL-12和IL-23的受體反應(yīng)性，產(chǎn)生相關(guān)下游效應(yīng)，而使個(gè)體更容易患病[10-11]。T細(xì)胞在IL12RB1正常的情況下可通過(guò)增強(qiáng)IFNG的表達(dá)發(fā)揮抵御病原體的作用[12]。當(dāng)IL12RB1雙等位基因1623_1624delinsTT突變時(shí)，會(huì)發(fā)生一種免疫缺陷綜合征，表現(xiàn)為對(duì)沙門(mén)氏菌、分枝桿菌和真菌感染等的增加[13]。在本研究中，首次發(fā)現(xiàn)IL12RB1基因rs393548和rs436857是HAPC的危險(xiǎn)因素，rs845380是女性人群的保護(hù)因素。Song等[14]發(fā)現(xiàn)高危人乳頭瘤病毒(hrHPV)感染患者的血清IL-12水平顯著低于健康對(duì)照者(P<0.01)，但病例對(duì)照研究顯示rs436857和rs393548等位基因頻率無(wú)顯著差異。說(shuō)明IL12RB1基因rs393548和rs436857并不在所有疾病中都顯著表達(dá)，SNPs導(dǎo)致的IL-12的變化對(duì)西藏世居人群HAPC的易感性可能具有一定影響。盡管本研究差異位點(diǎn)在初次經(jīng)過(guò) FDR/Bonferroni校正后不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但進(jìn)行后續(xù)差異基因SNP位點(diǎn)連鎖不平衡分析與單倍型分析后，此處幾個(gè)位點(diǎn)在組間表現(xiàn)出顯著性差異并形成了具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單倍型域。我們推測(cè)差異位點(diǎn)之間可能存在相互作用，導(dǎo)致單一位點(diǎn)差異性經(jīng)校正后出現(xiàn)不顯著的情況，并不否認(rèn)此處幾個(gè)位點(diǎn)的表達(dá)差異。

缺氧環(huán)境會(huì)導(dǎo)致IL-1β、TNF-α等多種細(xì)胞因子水平發(fā)生改變[15]。HAPC患者血清炎性細(xì)胞因子水平變化，存在IL-1β、IL-2、IL-15、TNF-α等多種參與調(diào)控EPO和HIF-1α等相關(guān)因素，當(dāng)反應(yīng)失調(diào)會(huì)造成機(jī)體氧自由基代謝紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞增殖、凋亡和壞死，出現(xiàn)炎性疾病，最終導(dǎo)致HAPC的發(fā)生[16]。HIF-1α在缺氧相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)活性的調(diào)控中起重要作用[17]。Shan等[18]在乳酸對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的實(shí)驗(yàn)中提到，HIF-1α信號(hào)通路中可能有IL-12表達(dá)下調(diào)的作用效果。我們發(fā)現(xiàn)可能是IL12RB1基因rs393548和rs436857位點(diǎn)的突變，影響了IL-12在HIF-1α信號(hào)通路正常發(fā)揮作用，導(dǎo)致患者體內(nèi)HIF含量增加，代償性導(dǎo)致紅細(xì)胞增多的發(fā)生。Tian等[19]在性別與缺血性卒中的研究中指出，影響IL-12、HIF-1α表達(dá)的基因只在女性患者中發(fā)揮作用，炎性因子在某些疾病的表達(dá)存在性別差異。HAPC的流行病學(xué)調(diào)查指出，男性群體相較于女性群體更易患病[20]。我們認(rèn)為可能是由于在女性IL12RB1基因rs845380引起的變化起到了保護(hù)性作用，而該SNP在男性不存在差異，因此對(duì)男性群體沒(méi)有抵抗HAPC作用，從而出現(xiàn)男性群體患病率高于女性群體的現(xiàn)象。

人類PDK1基因位于染色體2q31.1，編碼丙酮酸脫氫酶激酶1，在調(diào)節(jié)葡萄糖和脂肪酸代謝的體內(nèi)平衡中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[21]。抑制PDK1的表達(dá)使細(xì)胞中葡萄糖攝取增加和線粒體激活，導(dǎo)致活性氧(ROS)水平升高[22]。高原缺氧條件下ROS形成增多引起氧化應(yīng)激[23]，我們推測(cè)其中的機(jī)制可能與PDK1低表達(dá)有關(guān)。西藏世居人群中ROS上調(diào)HIF-1α水平，其介導(dǎo)的HIF-1α信號(hào)與HAPC患者胃損傷的病理機(jī)制有關(guān)[24]。但我們?cè)诒敬窝芯恐袥](méi)有發(fā)現(xiàn)PDK1基因上的顯著SNP，可能是HAPC患者HIF表達(dá)并不和病情完全一致。而TCL1A基因?qū)儆赥CL1家族的成員，位于染色體14q32.1[25]。該基因多態(tài)性的不同蛋白表達(dá)與性別差異有關(guān)。男性中，Y染色體嵌合體丟失(mLOY)患者的TCL1A基因rs2887399可能是疾病發(fā)生的危險(xiǎn)因素[26]，mLOY與特殊的血液疾病有關(guān)，包括急性髓系白血病、骨髓增生異常綜合征和白血病前期。女性中，雌二醇能誘導(dǎo)具有TCL1A基因 rs11849538變異序列的表達(dá)，產(chǎn)生功能性雌激素反應(yīng)元件[27]。但我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TCL1A基因存在任何顯著SNP，推測(cè)HAPC在西藏世居人群患病率的性別差異可能不是由TCL1A基因多態(tài)性引起。惡性血細(xì)胞大量積聚的原因可能與TCL1A基因表達(dá)失控有關(guān)[28]。HAPC患者存在紅細(xì)胞的代償性過(guò)度增生，但本次研究沒(méi)有發(fā)現(xiàn)確切的TCL1A基因SNP，這可能是TCL1A基因在該疾病作用的位點(diǎn)過(guò)于分散，也可能是由于TCL1A基因單倍型存在人群特異性[29]，而本次選取的人群不存在TCL1A基因多態(tài)性差異。

綜上，本研究進(jìn)一步闡明HAPC遺傳機(jī)制，發(fā)現(xiàn)IL12RB1基因rs393548、rs436857和rs845380位點(diǎn)與HAPC相關(guān)，而PDK1和TCL1A基因位點(diǎn)無(wú)明顯關(guān)聯(lián)。遺傳易感性往往是多基因缺陷導(dǎo)致，不能排除多基因聯(lián)合作用，這些位點(diǎn)具有深入跟蹤研究的價(jià)值，并可能為世居西藏的高原人群健康生活提供指導(dǎo)依據(jù)。