苗藥痛風(fēng)停湯對(duì)高尿酸血癥大鼠降尿酸機(jī)制研究

曹躍朋 馬武開(kāi) 劉正奇 安 陽(yáng)1 張雄峰 張藝 曾商禹 鐘琴

摘要 目的：通過(guò)探討痛風(fēng)停湯對(duì)高尿酸血癥大鼠血尿酸水平、血清黃嘌呤氧化酶（XO）濃度、腎小管上皮細(xì)胞的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（UAT）mRNA和尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（URAT1）mRNA的表達(dá)的影響，研究苗藥痛風(fēng)停湯的具體降尿酸作用機(jī)制。方法：將56只SD大鼠隨機(jī)分為苗藥痛風(fēng)停高、中、低組、空白組和模型組、別嘌醇組、苯溴馬隆組。除空白組每天給予普通飼料喂養(yǎng)外，其余各組均造成高尿酸血癥大鼠模型。模型組和空白組均予等量生理鹽水灌胃，其余各組分別予相對(duì)應(yīng)藥物灌胃，給藥7 d后檢測(cè)各組血清X(qián)O活性、尿酸及腎小管上皮細(xì)胞UATmRNA、URAT1mRNA的表達(dá)。結(jié)果：與模型組比較，1）降XO，除苯溴馬隆組、苗藥痛風(fēng)停低劑量組，其余各組均可降低血清X(qián)O濃度（均P<0.01）;別嘌醇組與苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組療效相當(dāng)（P>0.05）。痛風(fēng)停高、中劑量組比低劑量組降低XO效果更佳（P<0.05）。2）降尿酸，除苗藥痛風(fēng)停低劑量組，其余各觀察組均有較好的降尿酸作用（均P<0.01）;痛風(fēng)停高、中劑量組與別嘌醇組、苯溴馬隆組降尿酸效果相當(dāng)（P>0.05）。3）調(diào)節(jié)UATmRNA表達(dá)，痛風(fēng)停高劑量組可以上調(diào)UATmRNA表達(dá)（P<0.01），其余各組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。4）調(diào)節(jié)URATlmRNA表達(dá)，苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組及苯溴馬隆組均可以下調(diào)URATlmRNA表達(dá)（P<0.05），且效果相當(dāng)（P>0.05）。其余各組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。結(jié)論：苗藥痛風(fēng)停湯可能通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性及上調(diào)UATmRNA、下調(diào)URAT1mRNA的表達(dá)達(dá)到降低高尿酸血癥大鼠血尿酸濃度。

關(guān)鍵詞 苗藥痛風(fēng)停湯;高尿酸血癥;實(shí)驗(yàn)研究;黃嘌呤氧化酶;尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體

Study on the Mechanism of Miao Medicine Tongfengting Decoction on Decreasing Uric Acid in Hyperuricemia Rats

CAO Yuepeng1， MA Wukai1， LIU Zhengqi1， AN Yang1， ZHANG Xiongfeng1， ZHANG Yi2，3， ZENG Shangyu2，3， ZHONG Qin1

（1 The Second Affiliated Hospital， Guiyang University of Chinese Medicine， Guiyang 550003， China; 2 Research Center for

Academic Inheritance and Innovation of Ethnic Medicine of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu

611137， China; 3 College of Ethnic Medicine in Chengdu University of Traditional Chinese， Chengdu 611137， China）

Abstract Objective：To explore the effects of Tongfengting Decoction on serum uric acid level， serum XO concentration， UAT mRNA and URAT1 mRNA expression of renal tubular epithelial cells of hyperuricemia rats， and study the specific mechanism of uric acid-lowering effect of Miao medicine Tongfengting Decoction. Methods：A total of 56 SD rats were randomly divided into a Tongfengting low dose group， a medium dose group and a high dose group， a blank group， a model group， an allopurinol group and a benzbromarone group. Except for the blank group， which was fed to the common diet daily， the other groups were prepared into hyperuricemia model. The model group and the blank group were given the same amount of normal saline， and the other groups were given the corresponding drugs. All rats were dosed for 7 days， and on the seventh day after dosing， the serum uric acid level， serum XO concentration， UAT mRNA and URAT1 mRNA expression of renal tubular epithelial cells of every group rats were detected. Results：Compared with the model group：1）on decreasing the XO：except for the benzbromarone group and the Miao medicine Tongfengting low dose group， and the other groups can reduce the serum XO concentration（P<0.01）; the efficacy of the allopurinol group was similar to that of the Miao medicine Tongfengting high dose group and medium dose group（P>0.05）. The efficacy of the high dose group and medium dose group of Tongfengting were better than that of the low dose group（P<0.05）. 2）on reducing the uric acid level：except for the Miao medicine Tongfengting low dose group， the other treatment groups had better uric acid-lowering effect（P<0.01）; the efficacy of reducing uric acid level of the Miao medicine Tongfengting high dose group， medium dose group and the allopurinol group， the benzbromarone group were similar（P>0.05）. 3）on regulating the expression of UATmRNA：the UATmRNA expression was up-regulated in the Miao medicine Tongfengtin high dose group（P<0.01）， and the other groups were not statistically significant（P>0.05）. 4）on regulating the expression of URAT1mRNA：the URT1mRNA expressions were down-regulated in the Miao medicine Tongfengtin high dose group， medium dose group and the benzobromoma group（P<0.05）， and the efficacy of these groups were similar（P>0.05）. The other groups were not statistically significant（P>0.05）. Conclusion：The Miao medicine Tongfengtin Decoction can reduce the serum uric acid concentration in hyperuricemia rats by inhibiting the activity of xanthine oxidase， up-regulating the expression of UATmRNA and down-regulating the expression of URAT1mRNA.

Keywords Miao medicine Tongfengtin; Hyperuricemia; Experimental study; Xanthine oxidase; Urate transporter

中圖分類(lèi)號(hào)：R29;R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.005

痛風(fēng)（Gout）是由于長(zhǎng)期體內(nèi)嘌呤代謝紊亂或者尿酸排泄障礙而引起血尿酸升高、單鈉尿酸鹽（Monosodium Urate，MSU）沉積于關(guān)節(jié)所致的一種疾病，屬于代謝性風(fēng)濕病[1]。以反復(fù)的局部關(guān)節(jié)突發(fā)疼痛、局部或全身痛風(fēng)石形成及引起關(guān)節(jié)變形、腎臟功能損害及泌尿系結(jié)石甚至發(fā)生腎臟衰竭等為臨床特征。本病屬于中醫(yī)學(xué)“痹證（熱痹）”“歷節(jié)”“痛風(fēng)”等范疇?！皾駸帷笔菤v代醫(yī)家認(rèn)為痛風(fēng)發(fā)病的一個(gè)重要病因，有研究表明濕熱蘊(yùn)結(jié)證是急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中醫(yī)證的髙發(fā)證型[2]。中醫(yī)的“濕熱蘊(yùn)結(jié)”與苗醫(yī)藥中“火毒”理論在病機(jī)及對(duì)其治則上相一致?；诖耍覀儗⒅嗅t(yī)理論與苗醫(yī)相結(jié)合，提出痛風(fēng)的發(fā)病是由于濕濁久蘊(yùn)，化瘀化熱，終成“瘀毒”所致，治療當(dāng)以“清濁、解毒、化瘀”為主，應(yīng)用貴州苗族民間草藥組成痛風(fēng)停方。在前期實(shí)驗(yàn)研究及臨床觀察中我們發(fā)現(xiàn)苗藥痛風(fēng)停湯對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎療效確切，且未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)[3-5]。本研究通過(guò)構(gòu)建高尿酸血癥大鼠模型，加入苗藥痛風(fēng)停湯進(jìn)行干預(yù)，探討痛風(fēng)停湯對(duì)高尿酸血癥大鼠血尿酸水平、血清黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，XO）濃度、腎小管上皮細(xì)胞的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體（Urate Transporter，UAT）mRNA和尿酸鹽陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Urate-anion Transporter1，URAT1）mRNA表達(dá)的影響，研究苗藥痛風(fēng)停湯的具體降尿酸的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取4周齡清潔級(jí)SD雄性大鼠56只，平均體質(zhì)量（200±20）g，購(gòu)自于重慶滕鑫生物公司，許可證號(hào)：SCXK-（軍）2012-0011。在貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心同等條件下飼養(yǎng)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心采用空調(diào)控溫，室溫18～25 ℃，濕度55%～65%，12 h光照/黑暗循環(huán)，室內(nèi)有換氣設(shè)備。分籠飼養(yǎng)，采取自由進(jìn)食和飲水，每天更換木屑等墊料，大鼠適應(yīng)1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。給予大鼠以人道關(guān)懷。符合中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理管理?xiàng)l例（No.55，2001）和貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例規(guī)定。

1.1.2 藥物 別嘌醇片[世貿(mào)天階制藥（江蘇）有限責(zé)任公司，批號(hào)：20101047]。苯溴馬?。ㄒ瞬L(zhǎng)江藥業(yè)公司，批號(hào)：36384）。苗藥痛風(fēng)停方（大血藤、觀音草、芭蕉根、絡(luò)石藤、生石膏、川牛膝、川萆薢等）購(gòu)買(mǎi)于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院制劑室。

1.1.3 試劑與儀器 大鼠黃嘌呤氧化酶ELISA試劑盒（Rat XO ELISA KIT）（貴州賽蘭博有限科技公司，批號(hào)：20171012）;5%羧甲基纖維素鈉（天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司，批號(hào)：20110728）;氧嗪酸鉀鹽（Sigma公司，美國(guó)，批號(hào)：101310713）;10%的酵母飼料（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)：20130602）。ELISA酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific Oy，美國(guó)，型號(hào)：Bio-TeKELx800V型）;臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（長(zhǎng)沙邁佳森儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：TGL20M）;實(shí)時(shí)定量PCR儀器（Bio-Rad Laboratories，Inc，美國(guó)，型號(hào)：CFX96;）;電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：HWS12）;-20 ℃冰箱（中科美菱，型號(hào)：DW-FL270）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將56只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、痛風(fēng)停低劑量組、痛風(fēng)停中劑量組、痛風(fēng)停高劑量組、別嘌醇組、苯溴馬隆組，共7組，每組8只?？瞻讓?duì)照組每天給予蒸餾水10 mL/kg灌胃，普通飼料喂養(yǎng)。除空白組外，其余各組大鼠均予造模：將25 g氧嗪酸鉀鹽溶于0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）500 mL溶液中，250 mg/（kg·d）腹腔注射，同時(shí)給予質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的酵母飼料100 g/（kg·d）喂養(yǎng)，連續(xù)7 d。在造模第7天通過(guò)吸入異氟烷麻醉大鼠后，經(jīng)大鼠眼球后靜脈叢取血1～1.5 mL，檢測(cè)血清尿酸含量，若血清尿酸值高于正常組均值20%，說(shuō)明高尿酸血癥模型大鼠造模成功。

1.2.2 給藥方法與取材 痛風(fēng)?？偵幜繛?48 g，按照成人標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量60 kg根據(jù)人與大鼠體質(zhì)量確定大鼠等效劑量為中劑量約為（3.7 g/kg），等效劑量的1/2倍為低劑量（1.85 g/kg），等效劑量的2倍為高劑量（7.4 g/kg）[6]。別嘌醇取等效劑量0.3 mg/kg，苯溴馬隆取等效劑量為0.1 mg/kg。大鼠正常飼養(yǎng)1周后，參照上述造模，第7天目?jī)?nèi)眥取血測(cè)定用藥前血尿酸濃度。造模成功后分別給藥灌胃，其中模型對(duì)照組和空白對(duì)照組灌服等量生理鹽水，各組連續(xù)給藥7 d，1次/d。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法 于給藥第7天給藥后2 h開(kāi)腹進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血測(cè)定大鼠用藥后血尿酸、肌酐、尿素等濃度，并分離血清，測(cè)定血清中黃嘌呤氧化酶濃度，留取腎臟標(biāo)本，檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞中的UATmRNA和URAT1mRNA的表達(dá)量。

1.2.3.1 尿酸酶-過(guò)氧化物酶偶聯(lián)法檢測(cè)血尿酸水平，堿性苦味酸終點(diǎn)比色法檢測(cè)血肌酐水平。

1.2.3.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)血清黃嘌呤氧化酶活性 第14天給藥后2 h開(kāi)腹后進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，以3 000～3 500 r/min的速度，離心半徑15 cm，離心10 min，將血清和紅細(xì)胞迅速小心的分離，采用ELISA法檢測(cè)大鼠血漿黃嘌呤氧化酶活性，按照ELISA試劑盒要求，吸取澄清上清液進(jìn)行檢測(cè)黃嘌呤氧化酶含量。

1.2.3.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞中的UATmRNA和URAT1mRNA的表達(dá)量 RT-PCR法操作步驟根據(jù)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，等待反應(yīng)結(jié)束后，讀取并記錄目的基因及內(nèi)參基因的Ct值;將電腦中的數(shù)據(jù)拷出并計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量（相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct表示）;PCR條件如圖1。引物設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，多組間采用單因素方差分析，2組間比較用t檢驗(yàn)，不同時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，方差齊時(shí)，各組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，則采用Tamhance′s T2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物耗損情況 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中所有動(dòng)物均未脫落。

2.2 各組血清X(qián)O濃度比較 與空白組比較，模型組XO濃度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000<0.05）;與模型組比較，苗藥痛風(fēng)停高、中組及別嘌醇組XO濃度均明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與別嘌醇組比較，苗藥痛風(fēng)停低劑量組、苯溴馬隆組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組與別嘌醇組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組用藥前后血尿酸比較 模型組與空白組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），提示造模成功;與本組用藥前比較，除痛風(fēng)停低劑量組以外，其余各觀察組尿酸值均明顯下降（P<0.05）;與模型組比較，痛風(fēng)停高、中劑量組、別嘌醇組、苯溴馬隆組均有較明顯的降尿酸作用（P<0.05）;苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組降尿酸作用與別嘌醇、苯溴馬隆相當(dāng)（P>0.05），但優(yōu)于低劑量組（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 各組用藥前后血肌酐比較 各組用藥前后，測(cè)量血肌酐濃度，組內(nèi)及組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 細(xì)胞總RNA的檢測(cè)

2.5.1 內(nèi)參基因β-actin的RT-PCR曲線圖 見(jiàn)圖2、3。

2.5.2 目的基因UAT的RT-PCR曲線圖 見(jiàn)圖4、5。

2.5.3 目的基因URATl的RT-PCR曲線圖 見(jiàn)圖6、7。

2.6 目的基因UAT、URATl定量結(jié)果

2.6.1 UATmRNA基因相對(duì)表達(dá)量比較 空白組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示造模成功。與模型組比較，痛風(fēng)停高劑量組可以增加UATmRNA基因表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其余各組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見(jiàn)表5。

2.6.2 UAT和URAT1mRNA基因相對(duì)表達(dá)量比較：空白組與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），提示造模成功。與模型組比較，苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組及苯溴馬隆組URAT1mRNA基因表達(dá)均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），且3組療效相當(dāng)（P>0.05）。余各組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P>0.05）。見(jiàn)表5。

3 討論

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制仍未明確，目前比較一致的觀點(diǎn)是各種原因引起的高尿酸血癥。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)高尿酸血癥患者有5%～12%的概率可進(jìn)一步發(fā)展成為痛風(fēng)[7-8]，而80%～90%的痛風(fēng)患者伴隨著高尿酸血癥[9]。XO是嘌呤分解代謝最后步驟中一種很重要的酶，主要參與核酸的代謝[10]，次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶的作用下生成黃嘌呤，再進(jìn)一步生成尿酸和自由基[11]。研究發(fā)現(xiàn)，XO活性增高可以導(dǎo)致原發(fā)性高尿酸血癥和痛風(fēng)[12]。對(duì)XO的研究是抗高尿酸血癥和痛風(fēng)藥物研究的重點(diǎn)。

人體尿酸的以腎臟排泄途徑為主，經(jīng)尿道排出，約占總排泄量的2/3;其次為腸道排泄，或在腸道內(nèi)被細(xì)菌尿酸氧化酶分解，約占總排泄量的1/3[13]。目前有4種尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白參與人近曲腎小管轉(zhuǎn)運(yùn)[14]：生電型的尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子/通道（Human Urate Transporter，hUAT）、電中性的尿酸鹽/陰離子交換子（Human Urate Anionex Changer，hURAT1）、有機(jī)陰離子家族成員（Human Organic Anion Transporter，hOAT1）hOAT1和（Human Organic Anion Transporter，hOAT3）hOAT3[15]。其中hURAT1是維持血尿酸水平的關(guān)鍵離子通道，位于近端腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣，主要參與近曲腎小管對(duì)尿酸鹽的重吸收。膜表達(dá)蛋白hUAT作為貫穿細(xì)胞膜的高度選擇性離子通道，是生電型尿酸鹽/陰離子交換體，主要參與腎近曲小管對(duì)尿酸鹽的分泌，為調(diào)節(jié)腎尿酸分泌的關(guān)鍵物質(zhì)[16-17]。故hUAT蛋白或基因表達(dá)下降，hURAT1基因或蛋白表達(dá)提高為HUA發(fā)病的可能機(jī)制[18-19]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在降低黃嘌呤氧化酶濃度方面：除苯溴馬隆組、苗藥痛風(fēng)停低劑量組以外，其余各組均可降低黃嘌呤氧化酶濃度，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組與別嘌醇組降尿酸作用相當(dāng)，其療效比低劑量組明顯。在降尿酸方面：各觀察組與模型組比較，苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組及別嘌醇組、苯溴馬隆組均有較明顯的降尿酸作用。苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組療效明顯，且與別嘌醇、苯溴馬隆相當(dāng)。對(duì)于UATmRNA基因相對(duì)表達(dá)量的影響，苗藥痛風(fēng)停高劑量組可以上調(diào)UATmRNA基因表達(dá);對(duì)于URAT1mRNA基因相對(duì)表達(dá)量的影響，苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組、苯溴馬隆組可以下調(diào)URAT1mRNA基因表達(dá)，且作用相當(dāng);故苗藥痛風(fēng)停湯可降低高尿酸血癥大鼠血尿酸含量，以苗藥痛風(fēng)停高、中劑量組療效較好，呈劑量依賴(lài)性。其降尿酸作用可能是通過(guò)抑制URATl基因的表達(dá)、上調(diào)UAT基因的表達(dá)，抑制黃嘌呤氧化酶活性共同實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，我們認(rèn)為苗藥痛風(fēng)停湯能夠通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶活性及上調(diào)UATmRNA、下調(diào)URAT1mRNA的表達(dá)實(shí)現(xiàn)降尿酸作用，且其不良反應(yīng)小，值得在臨床上進(jìn)一步推廣使用。

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（2021-06-10收稿 責(zé)任編輯：王明）

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2017YFC1703904）;國(guó)家自然基金項(xiàng)目（81660811）;貴州省科技計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合LH字[2016]7128號(hào)）;貴陽(yáng)市科技計(jì)劃項(xiàng)目（筑科合同[2019]-9-4-27號(hào)）;貴州省教育廳青年科技人才成長(zhǎng)項(xiàng)目（黔教合KY字[2018]217）

作者簡(jiǎn)介：曹躍朋（1986.02—），男，碩士研究生，主治醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕免疫病防治，E-mail：1037481658@qq.com

通信作者：鐘琴（1963.04—），女，本科，主任醫(yī)師，研究方向：中西醫(yī)結(jié)合風(fēng)濕免疫病防治，E-mail：gycyp2013@163.com