消癥散結(jié)栓對大鼠細菌性陰道炎的治療作用與機制研究

呂邵娃，黃雨婷，劉玉甜，郭玉巖，周 金，李永吉*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江鶴翔制藥有限責(zé)任公司，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

細菌性陰道炎（bacterial vaginosis，以下簡稱BV）疾病的對象多為已婚女性，是臨床常見的一種婦科疾病，中醫(yī)學(xué)的研究重點領(lǐng)域一般認為，BV的臨床致病性和危害范圍屬“陰癢”“帶下病”[1]。其主要病因是“濕”邪侵入機體，或肝經(jīng)濕熱侵襲下體，或由濕腐生蟲、蟲邪直犯陰器所導(dǎo)致。根據(jù)女性生理結(jié)構(gòu)的特殊性，常用外治法治療BV，獨特性在于促使藥物直達病灶，發(fā)揮藥效，抑制毒邪生長，加快機體腸黏膜對藥物的吸收[2-3]。同抗生素類藥物對比，中藥制劑無明顯的耐藥性。散結(jié)乳癖消貼膏（國藥準(zhǔn)字：Z20040073）是由莪術(shù)、姜黃、白芷、急性子、天葵子、木鱉子6味中藥組成，具有行氣活血、散結(jié)消腫的作用，用于氣滯血瘀所致的乳癖。臨床使用發(fā)現(xiàn)其可以有效地抑制引起感染的致病菌[4]，如白色念珠菌等其它相關(guān)致病菌。本實驗所用藥物為消癥散結(jié)栓，是經(jīng)過中醫(yī)辨證論治對散結(jié)乳癖消貼膏的二次開發(fā)[5]，在原處方的基礎(chǔ)上，增加了一味藤黃藥材，藤黃具有消腫、攻毒、祛腐斂瘡、殺蟲的功效，此新型栓劑擬用于治療具有炎癥反應(yīng)的陰道感染性疾病。本實驗采用金黃色葡萄球菌-白色念珠菌混合液建立BV大鼠模型，通過考察消癥散結(jié)栓改善大鼠BV 的功效及相關(guān)病理學(xué)分析，來驗證消癥散結(jié)栓對BV大鼠的治療作用，為臨床治療 BV 提供新型藥物。

1 材料

1.1 實驗動物

雌性SD大鼠60只，清潔級，體質(zhì)量為200 ～260 g，購于青島大任實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK（遼）2015-0001。動物實驗經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)（編號：RL15008）。

1.2 實驗試劑

消癥散結(jié)栓（自制） ；消糜栓（批號：Z20025663，通化萬通藥業(yè)有限公司）；苯甲酸雌二醇（批號：20160101，天津必佳藥業(yè)集團有限公司）；金黃色葡萄球菌（BNCC 186335）、白色念珠菌（BNCC 186382）、前列腺素2（PGE2）、前列腺素 2α（PGF2α）、白細胞介素-1β（IL-1β）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-8（IL-8）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）均購自于上海江萊生物有限公司；PBS液（美國康寧公司）；ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）。

1.3 實驗儀器

Labo LB-2004型電子分析天平（藍博惠科有限公司）；CKX31-A12PHP型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；SB-5200D型數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；BJ-2CD型垂直凈化工作臺（上海博訊儀器有限公司）；ZHP-100型恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海精其儀器有限公司）。

2 方法

2.1 BV 小鼠模型制備

配制濃度為0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊慕瘘S色葡萄球菌和白色念珠菌的菌懸液。按1∶1的比例進行混合，配制成感染菌液。取自然狀態(tài)下健康的雌性大鼠，于第1、3和5天對大鼠皮下注射10 mg/kg的苯甲酸雌二醇注射液。無菌緩沖液清洗大鼠陰道3次后吸取適量的混合菌液，輕緩的插入大鼠陰道約1 ～ 1.5 cm處，每日接菌量為0.5 mL/kg, 連續(xù)7 d。菌株接種后，每日觀察大鼠陰道變化情況。當(dāng)大鼠陰道外觀出現(xiàn)明顯充血、發(fā)紅、變腫且有大量白色黏性分泌物時，取分泌物進行涂板觀察及培養(yǎng)，在顯微鏡下觀察，可見大量的壞死細胞和細菌，平板內(nèi)大量菌株生長旺盛，表明大鼠陰道的環(huán)境已被菌株破壞，大鼠BV模型建立成功。

2.2 實驗分組及給藥方法

按照“2.1”項下方法，向陰道注入細菌7 d后全部呈現(xiàn)陰道炎癥狀，表明造模成功。將模型大鼠隨機分為6組，每組10只，即空白組、模型組、消癥散結(jié)栓高劑量組、消癥散結(jié)栓中劑量組、消癥散結(jié)栓低劑量組以及陽性藥組。除空白組及模型組不予處理外，消癥散結(jié)栓高、中、低劑量組分別按200、100、50 mg/kg的劑量給藥。陽性藥組則以消糜栓100 mg/kg陰道給藥。連續(xù)給藥14 d，于末次給藥24 h后，磷酸鹽緩沖液充分的灌洗大鼠陰道，收集灌洗液于無菌管中。次日處死大鼠，將大鼠陰道及子宮等組織進行剝離保存，用于檢測炎癥因子含量及相關(guān)病理學(xué)檢查。

2.3 ELISA 法檢測小鼠陰道分泌物中炎癥因子

用無菌膠頭滴管吸取適量PBS緩沖液，伸入雌鼠陰道內(nèi)，收集各實驗組的大鼠的陰道灌洗液。剪取大鼠子宮組織，經(jīng)研磨、裂解、勻漿、離心，取上清液，相關(guān)處理后，按試劑盒說明進行操作。

2.4 HE染色考察大鼠陰道組織病變程度

取大鼠部分陰道組織，浸泡于10%的甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、切片（4 μm），HE染色后，置于顯微鏡下，進行大鼠陰道組織的病理學(xué)分析。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對BV大鼠陰道口外觀的影響

與空白組比較，模型組大鼠陰道口處發(fā)紅、腫脹，可見白色黏性的陰道分泌物，少數(shù)出現(xiàn)糜爛現(xiàn)象；消癥散結(jié)栓的高、中劑量組及陽性藥組的大鼠外陰均恢復(fù)正常的外觀。陰道粘膜光滑,無潰病及糜爛,結(jié)構(gòu)清楚。消癥散結(jié)栓的低劑量組陰道外觀有輕度充血、紅腫,有少量膿性分泌物。

3.2 BV大鼠模型的陰道組織切片HE染色

通過HE 染色進行病理學(xué)檢查，結(jié)果表明, 空白組黏膜上皮光滑、無壞死組織脫落、固有層為致密結(jié)締組織，未見充血水腫及炎細胞浸潤；模型組陰道壁變厚，上皮細胞壞死，固有層出現(xiàn)充血和水腫，以中性粒細胞為主，淋巴細胞和單核細胞炎細胞浸潤，纖維細胞增生明顯，說明該模型造模成功；與模型組比較，消癥散結(jié)栓高、中、低劑量組、陽性藥組病理組織切片中，中性粒細胞浸潤均不同程度減少，陰道黏膜上皮細胞不同程度增厚，尤其是消癥散結(jié)栓高、中劑量組陰道組織切片中黏膜完整、粘膜下組織基本恢復(fù)正常。結(jié)果見圖1。

圖1 各組陰道組織的HE染色結(jié)果比較（200×）Fig.1 Comparison of HE staining results of vaginal tissue in each group（200×）

3.3 消癥散結(jié)栓對BV大鼠陰道中TNF-α、IL-6、IL-1β炎癥因子分泌的影響

用ELISA 法檢測大鼠陰道分泌物中TNF-α、IL-6、IL-1β水平，結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組的TNF-α、IL-6以及IL-1β水平明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，消癥散結(jié)栓各劑量組的TNF-α、IL-6、IL-1β水平明顯降低（P＜0.05），且消癥散結(jié)栓高劑量組作用更加明顯，消癥散結(jié)栓中、高劑量組優(yōu)于陽性藥組，結(jié)果見表1。

表1 消癥散結(jié)栓對BV大鼠陰道分泌物中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響±s，n = 5）Tab. 1 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on TNF-α, IL-6 and IL-1β levels in vaginal secretions of BV rats±s，n = 5）

表1 消癥散結(jié)栓對BV大鼠陰道分泌物中TNF-α、IL-6、IL-1β水平的影響±s，n = 5）Tab. 1 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on TNF-α, IL-6 and IL-1β levels in vaginal secretions of BV rats±s，n = 5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P＜0.05,##P＜0.01。

空組白別組（劑mg-量/k g/）2.8 T9N±F 0-.α 0 4** 2.74 I L±-0 6.4 5** 3.1 I2L±- 10β.28*模型組 - 3.85 ± 0.43## 4.39 ± 0.64## 3.72 ± 0.33#消癥散結(jié)栓50 3.19 ± 0.23*# 2.85 ± 0.13** 3.16 ± 0.16**低劑量組消癥散結(jié)栓100 2.89 ± 0.11** 2.66 ± 0.41** 2.98 ± 0.33**中劑量組消癥散結(jié)栓200 2.81 ± 0.26** 2.32 ± 0.47** 2.91 ± 0.18**高劑量組陽性藥組 100 3.02 ± 0.01**## 2.74 ± 0.14** 2.84 ± 0.19**#F 16.878 18.227 5.247 P 0.000 0.000 0.001

3.4 消癥散結(jié)栓對BV大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β炎癥因子分泌的影響

用ELISA 法檢測大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β水平，結(jié)果顯示，模型組的TNF-α、PGE2α及IL-1β水平高于空白組（P＜0.05）；消癥散結(jié)栓各劑量組的TNF-α、PGE2α、IL-1β水平低于模型組（P＜0.05），且消癥散結(jié)栓高劑量組作用明顯，優(yōu)于陽性藥組，結(jié)果見表2。

表2 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β及水平的影響±s，n = 5）Tab. 2 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on serum levels of TNF-α, PGE2α and IL-1β in BV rats±s，n = 5）

表2 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠血清中TNF-α、PGE2α、IL-1β及水平的影響±s，n = 5）Tab. 2 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on serum levels of TNF-α, PGE2α and IL-1β in BV rats±s，n = 5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P< 0.05，##P < 0.01。

組別 （劑mg量/kg/） TNF-α PGE2α IL-1β空白組 - 2.07 ± 0.24** 1.94 ± 0.07* 1.81 ± 0.04*模型組 - 4.11 ± 0.65## 3.12 ± 0.96# 2.75 ± 0.90#消癥散結(jié)栓50 1.92 ± 0.12** 2.07 ± 0.33* 1.81 ± 0.12*消低癥劑散量結(jié)組栓100 1.88 ± 0.19** 1.98 ± 0.33* 1.74 ± 0.21*消中癥劑散量結(jié)組栓200 1.35 ± 0.58**# 1.91 ± 0.25** 1.69 ± 0.20**高陽劑性量藥組組 100 1.86 ± 0.11**# 1.94 ± 0.14**## 1.72 ± 0.11*F 37.661 5.247 9.360 P 0.000 0.001 0.000

3.5 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠子宮組織中PGF2α及PGE2水平的影響

模型組的PGE2、PGE2α水平高于空白組（P＜0.05）；消癥散結(jié)栓各劑量組的PGE2、PGE2α水平低于模型組（P＜0.05），但弱于陽性藥組。結(jié)果見表3。

表3 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠子宮PGE2、PGE2α水平的影響±s，n = 5）Tab. 3 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on PGE2 and PGE2α levels in uterus of BV rats±s，n = 5）

表3 消癥散結(jié)栓對BV 大鼠子宮PGE2、PGE2α水平的影響±s，n = 5）Tab. 3 Effects of Xiaozhengsanjie Suppositories on PGE2 and PGE2α levels in uterus of BV rats±s，n = 5）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，#P< 0.05，##P< 0.01。

組別 劑量/（mg/kg） PGE2 PGE2α空白組 - 3.09 ± 0.38** 3.22 ± 0.29**模型組 - 4.76 ± 0.60## 3.88 ± 0.32##消癥散結(jié)栓50 3.70 ± 0.29**## 3.39 ± 0.32*低劑量組消癥散結(jié)栓100 3.31 ± 0.09** 3.28 ± 0.13**中劑量組消癥散結(jié)栓200 3.21 ± 0.26** 3.22 ± 0.22**高劑量組陽性藥組 100 3.01 ± 0.31** 3.35 ± 0.15**F 20.016 7.534 P 0.000 0.000

4 討論

女性陰道黏膜極易受到各種有害細菌的直接侵害導(dǎo)致感染[6-8]。其病因復(fù)雜，多種因素均可導(dǎo)致炎癥發(fā)生?；颊卟“Y反復(fù)，病程較長，不易根除。臨床研究發(fā)現(xiàn)，BV患者的陰道分泌物中可檢查到致病菌的存在，同時在患者的陰道組織中有數(shù)目較大的炎癥因子存在[9]。通過對炎癥因子的檢測發(fā)現(xiàn)，常見的致病因子其中包括 TNF-α，還有白介素類，如IL-6、IL-1β，其中 TNF-α在患者感染初期便可以被檢查到，且大量存在。當(dāng)TNF-α、IL-1β及IL-6大量存在時，可誘導(dǎo)機體前列腺素的分泌，典型的為PGE2與 PGF2α。大量的炎癥黏附因子主要存在于炎癥細胞機體，其大量存在使組織器官受損[10]。本實驗主要探討了中藥復(fù)方消癥散結(jié)栓對抗細菌性陰道炎的作用及機制。

本實驗所采用的藥物消癥散結(jié)栓是由藤黃、莪術(shù)、姜黃、白芷、急性子、天葵子、木鱉子7味中藥經(jīng)粉碎后，與適量蜂蜜混合進行發(fā)酵，后與適宜的基質(zhì)混合而組成的復(fù)方制劑。方中君藥為藤黃，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藤黃具有廣譜抗菌作用，其活性可以抑制真菌及病原蟲的生長及繁殖[11]。姜黃的藥理作用表現(xiàn)在殺菌、抗炎等，其在治療癌癥方面也有所應(yīng)用。同時姜黃可以提高機體的免疫能力，對抗疾病的發(fā)生[12]。莪術(shù)及白芷均具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病毒等作用。相關(guān)研究證實，急性子有效部位的提取物可以通過抑制相關(guān)蛋白的表達，同時誘導(dǎo)細胞凋亡，從而對前列腺癌細胞的生長起到抑制作用[13]。天葵子善清熱解毒、消腫散結(jié)、利水通淋，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)常用作預(yù)防和治療女性卵巢癌等疾病。木鱉子的現(xiàn)代研究甚少，其研究現(xiàn)狀大多為木鱉子的抗腫瘤及對癌癥的治療，其有效成分皂苷對白色念珠菌及其它真菌具有顯著的抑制作用。全方配伍，藥少力專，有消癥散結(jié)、 活血通經(jīng)、行氣止痛之功效，適用于癥瘕積聚、氣滯血瘀證。同時本藥在抑菌方面的顯著成效為新制劑的研究奠定了基礎(chǔ)[14]。

體內(nèi)實驗結(jié)果顯示，在給予BV模型大鼠消癥散結(jié)栓治療后，對比空白組與模型組間大鼠血清的相關(guān)數(shù)據(jù)，模型組的TNF-α、PGE2α及IL-1β水平顯著升高，對比模型組與各給藥組之間的相關(guān)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，其中各給藥組中的TNF-α、PGE2α、IL-1β水平顯著降低，各給藥組的大鼠子宮組織中， PGE2、PGF2α含量水平較模型組顯著減少。表明消癥散結(jié)栓可減少 PGF2α、PGE2水平，通過減少其表達來抑制前列腺素的分泌。多次給藥證實消癥散結(jié)栓對大鼠陰道組織無刺激性作用。通過對大鼠陰道口外觀的觀察及陰道組織切片病理學(xué)檢驗表明消癥散結(jié)栓能抗金黃色葡萄球菌、白色念珠菌感染引起的大鼠細菌性陰道炎。

5 結(jié)論

消癥散結(jié)栓對BV模型大鼠的疾病癥狀具有明顯的治療作用，其作用機制可能是通過抑制BV模型大鼠陰道內(nèi)的炎癥因子的釋放從而減少 PGF2α、PGE2水平，減少其表達來抑制前列腺素的分泌從而緩解BV的炎癥反應(yīng)。因此，消癥散結(jié)栓對細菌性陰道炎治療具有一定應(yīng)用價值。本實驗為治療女性陰道感染等疾病的新藥研制提供了重要的參考。