安徽省部分散養(yǎng)雞場球蟲感染情況的調(diào)查

姚婧婷，尤向峰，李明珠，葛 寧，馮學松，劉欣超，顧有方，李文超*

(1.安徽科技學院動物科學學院，安徽鳳陽 233100；2.廣德市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，安徽宣城 242200)

雞球蟲病是由艾美耳球蟲寄生于雞腸道引起的一種嚴重的原蟲病，臨床上常見多發(fā)，可給養(yǎng)雞造成巨大的經(jīng)濟損失[1]。傳統(tǒng)上，不同雞球蟲蟲種的鑒定主要依賴于球蟲卵囊和孢子囊形態(tài)、寄生部位及病變特征等，費時費力，且不能精確區(qū)分不同蟲種[2]。PCR技術(shù)因其具有簡便、快速、靈敏度高的優(yōu)點，已逐漸應用到球蟲分類領域。目前，已發(fā)展了不少鑒別不同種雞球蟲的PCR方法，常用的靶基因有18S rDNA、5S rDNA、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer 1，ITS，包括ITS-1和 ITS-2)以及特征序列擴增區(qū)(sequence characterized amplified regions,SCAR)基因等，其中基于ITS基因的PCR已廣泛應用于雞球蟲病的診斷及流行病學調(diào)查中[2-4]。

國內(nèi)有關(guān)雞球蟲病流行病學方面的研究較多，但相關(guān)研究基本上是采用飽和鹽水漂浮糞便，鏡檢觀察卵囊形態(tài)進而鑒別感染蟲種的傳統(tǒng)方法[5]。國內(nèi)采用分子生物學方法對雞球蟲進行調(diào)查的報道不多，目前僅見山東省、浙江省和安徽省有相關(guān)報道[6-9]。安徽省是養(yǎng)雞大省，已有研究顯示安徽省雞球蟲感染率較高[8-11]。為彌補相關(guān)報道調(diào)查地域狹窄等不足，及時反映安徽省雞群球蟲感染狀況，采用分子生物學方法對安徽省多地散養(yǎng)雞群球蟲感染情況進行調(diào)查，以期為安徽省雞球蟲病防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 829份新鮮雞糞便于2017年10月至2018年7月期間分別采集自安徽省滁州市明光市、淮南市鳳臺縣、阜陽市太和縣、宿州市埇橋區(qū)、六安市金安區(qū)、宣城市寧國市的7個散養(yǎng)雞場。上述雞場飼喂雞用商品化飼料或自配飼料，一般添加有馬杜拉霉素或地克珠利等抗球蟲藥物，且以前從未使用過任何球蟲疫苗產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑 糞便基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；重組TaqDNA聚合酶，三羧酸脫氧核糖核苷酸混合液dNTP，DNA標志物(DNA Marker DL 2 000)，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 T100型梯度PCR儀、電泳儀、電泳槽，Bio-Rad公司產(chǎn)品；Tan2500R凝膠圖像處理系統(tǒng)，天能公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 糞便基因組DNA提取 參照糞便基因組DNA提取試劑盒說明書進行，所得DNA置-20 ℃保存。

1.2.2 艾美耳球蟲的PCR擴增 7種艾美耳球蟲ITS-1基因的擴增參照Lew A E等[2]的引物與方法。引物見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。兩輪PCR反應體系均為25 μL，包括0.15 μL rTaq酶(5 U/μL)，2 μL dNTP(2.5 mmol/L)，2.5 μL 10×PCR緩沖液，0.25 μL正反引物(20 mol/L)，模板2 μL。首輪PCR引物為艾美耳屬球蟲特異性引物，模板用提取的雞糞便基因組DNA，反應條件為：預變性94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸15 min。第二輪PCR引物分別為7種艾美耳球蟲種特異性引物，模板為2 μL首輪PCR產(chǎn)物，反應條件除退火溫度外，其余與首輪PCR條件一致(表1)。

表1 本研究中所用的PCR引物及條件

續(xù)表1

1.2.3 PCR產(chǎn)物測序及分析 所有第二輪PCR產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，根據(jù)PCR預期擴增片段的情況來統(tǒng)計相應球蟲蟲種的感染情況。為進一步驗證所獲不同艾美耳球蟲陽性樣本的真實性，從7種雞艾美耳球蟲陽性樣本中隨機各挑選5個第二輪PCR擴增產(chǎn)物，送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。所得序列經(jīng)DNAMan v9.0軟件軟件進行比對和加工，在GenBank中進行Blast搜索，以驗證其是否是相應雞球蟲ITS-1序列。

2 結(jié)果

2.1 多種艾美耳球蟲ITS-1基因PCR擴增及序列分析

829份樣本，共擴增出57份柔嫩艾美耳球蟲(Eimeriatenella)、172份E.acervulina、173份E.maxima、20份毒害艾美耳球蟲(Eimerianecatrix)、17份布氏艾美耳球蟲(Eimeriabrunetti)、147份E.mitis和6份早熟艾美耳球蟲(Eimeriapraecox)陽性樣本，擴增產(chǎn)物大小均符合預期，見圖1和圖2。隨機選取測序的35個艾美耳球蟲ITS-1基因均測序成功，序列經(jīng)分析，均為雞7種艾美耳球蟲ITS-1基因。

2.2 安徽省散養(yǎng)雞艾美耳球蟲感染情況

PCR檢測顯示，本次調(diào)查的所有散養(yǎng)雞場均有球蟲感染，場感染率為100%?；茨想u場檢出所有7種球蟲，滁州、宿州和宣城1雞場檢出6種球蟲，其余4個雞場均檢出4種雞球蟲。E.acervulina、E.maxima和E.mitis是本次調(diào)查最常見的蟲種，感染率分別為20.75%、20.87%和17.73%，其次是E.praecox(7.24%)、E.tenella(6.88 %)、E.necatrix(2.41%)和E.brunetti(2.05%)。其中，E.tenella在除宿州外的其他雞場均有檢出，感染率為0～11.72%，E.acervulina在所有雞場均有檢出，感染率為10.74%～44.00%，E.maxima也在所有雞場均有檢出，感染率為10.74%～29.31%，E.necatrix在宿州、淮南、宣城1和六安4個雞場均有檢出，感染率為0～9.48%，E.brunetti除六安外的其他雞場均有檢出，感染率為0～5.17%，E.mitis也在所有雞場均有檢出，感染率為1.65%～59.26%，E.praecox在滁州、宿州和淮南3個雞場檢出，感染率為0～8.00%(表2)。混合感染很普遍，尤以E.acervulina+E.maxima，E.acervulina+E.mitis，E.maxima+E.mitis及E.acervulina+E.maxima+E.mitis混合感染較為常見，其中E.acervulina和E.maxima是最常參與混合感染的蟲種(表3)。

表3 安徽省散養(yǎng)雞群球蟲混合感染情況

A.Mit1；B.Mit5;M.DNA 標準DL 2 000;1～7.樣品

M.DNA 標準DL 2 000;1～5.樣品

3 討論

對球蟲感染進行定期檢測與監(jiān)測，是預防雞球蟲病的有效手段[3]?；赑CR的分子生物學檢測方法不僅可精準鑒定不同球蟲蟲種，還可定量球蟲感染強度及精確監(jiān)測養(yǎng)殖環(huán)境中的球蟲分布等，而且該類方法在大批量樣品檢測中更具優(yōu)勢[5]。本研究利用不同種雞球蟲ITS-1基因的套式PCR對安徽省多地散養(yǎng)雞7種球蟲感染情況進行調(diào)查，以期為我省散養(yǎng)雞球蟲病防控提供參考。

本研究中，所調(diào)查的7個雞場均檢出有球蟲感染，場感染率為100%，這一結(jié)果與多個有關(guān)安徽省雞群球蟲流行的報道一致，顯示安徽省雞群球蟲感染情況比較普遍[8-11]。分析其原因，可能與安徽省氣候條件比較適合球蟲發(fā)育及雞場飼養(yǎng)管理不規(guī)范有一定的關(guān)系，尤其是散養(yǎng)雞場，多采用地面平養(yǎng)方式，雞場衛(wèi)生條件較差，飼養(yǎng)管理較為粗放，雞在地面自由采食，非常容易攝入球蟲孢子化卵囊而感染。本研究中，各雞場均有球蟲檢出，但雞群并沒有明顯的球蟲病臨床癥狀，顯示雞群可能處于亞臨床感染狀態(tài)，可因增重緩慢和降低飼料報酬而造成巨大的隱性經(jīng)濟損失，應引起高度重視[7]。此外，本研究中安徽省散養(yǎng)雞群球蟲感染率很高，而本次調(diào)查的雞群在日常養(yǎng)殖中均使用抗球蟲藥進行預防，提示在上述散養(yǎng)雞群中可能存在較為廣泛的球蟲耐藥蟲株的流行[6]。

從球蟲蟲種的分布情況來看，本次共檢獲7種雞球蟲，這一結(jié)果與山東省和安徽省的相關(guān)報道一致[6,9-10]。Huang Y等[8]對安徽省規(guī)?；u場的調(diào)查發(fā)現(xiàn)存在6種球蟲蟲種，而浙江省及其他關(guān)于安徽省雞群的相關(guān)報道均檢出5種球蟲蟲種[7,11]。本研究中，E.acervulina、E.maxima和E.mitis是最常見的蟲種，這一結(jié)果與山東省、浙江省及安徽省的多個相關(guān)報道不同，顯示雞球蟲在不同地理區(qū)域的分布和流行不盡相同[6-11]。研究顯示，擁擠效應和艾美耳球蟲種間的相互作用是影響球蟲卵囊產(chǎn)生的最重要因素，E.acervulina有最高的生殖潛力，在混合感染的情況下，E.acervulina能降低E.brunetti,E.maxima,E.tenella和E.necatrix的卵囊產(chǎn)量[3,8]。本研究中，E.acervulina是最頻繁參與混合感染的球蟲蟲種，這可能是本研究中臨床上危害最為嚴重的球蟲蟲種E.tenella感染率不高的一個重要原因。

綜上所述，本研究顯示安徽省散養(yǎng)雞群中球蟲的感染率較高，故應采取綜合性措施加強對球蟲感染的防控，E.acervulina、E.maxima和E.mitis等3種蟲種是防控的重點。其次，在應用球蟲藥物防控球蟲病時，要高度重視球蟲的耐藥性問題，尤其是在禁止使用化學藥物的背景下，可采用中草藥抗球蟲或雞球蟲疫苗免疫的方法來預防球蟲病[5]。