血清β-羥丁酸水平對貓脂肪肝的診斷及預后價值分析

朱道仙，陸 江，郝福星，吳 植，劉 莉

(1.江蘇農牧科技職業(yè)學院動物醫(yī)學院，江蘇泰州 225300；2.江蘇農牧科技職業(yè)學院寵物科技學院，江蘇泰州 225300；3.江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇泰州 225300)

貓脂肪肝(Feline hepatic lipidosis，F(xiàn)HL)是貓最常見的肝膽疾病，如不進行積極有效地治療,病死率可達90%以上，嚴重危害貓的健康與生命[1]。目前，該病的診斷主要依賴臨床癥狀特征、血液生化、影像學檢查及病理學檢測等[2-3]。這些方法還存在一定的局限性，如臨床癥狀及血液生化易于其他肝病混淆，B超檢查很難區(qū)分FHL與肥胖癥，病理學檢測具有創(chuàng)傷性易引發(fā)肝出血等缺點，容易造成漏診和誤診，降低了治療效果。雖然有些新的診斷方法報道[4-5]，但由于操作復雜或價格昂貴，未在臨床普及。因此，臨床上缺乏可靠的檢測手段來協(xié)助貓脂肪肝的診斷與預后。

β-羥丁酸(BHBA)是脂肪酸氧化產生的一種中間代謝產物，正常情況下能很快被分解利用，血液中含量很低，當BHBA產生過量時可積聚于血液中，形成酮血癥[6]。有研究表明，BHBA與貓脂肪肝的發(fā)生發(fā)展密切相關[7]。本研究回顧性收集了大量貓脂肪肝的病例，旨在分析血清BHBA在貓脂肪肝中的表達情況及其相關性，為該病的診斷和預后提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 β-羥丁酸檢測試劑盒，寧波瑞源生物科技有限公司產品；血糖、總蛋白、三酰甘油、總膽固醇、總膽紅素、丙氨酸氨基轉移酶、天門冬氨酸氨基轉移酶及堿性磷酸酶等指標檢測試劑，愛德士生物科技公司產品。

1.1.2 儀器設備 CatalystDx動物生化分析儀，美國愛德士生物科技公司產品；DU8-M6全數(shù)字彩色B超儀，徐州市瑞華電子科技發(fā)展有限公司產品；Multiskan GO酶標儀，賽默飛世爾科技公司產品。

1.1.3 臨床樣本 樣本采自2017年1月至2019年12月在江蘇農牧科技職業(yè)學院教學寵物醫(yī)院就診的患貓，根據(jù)癥狀學特征(黃疸、嘔吐及厭食)、血液生化指標(肝功能異常)和肝臟B超檢查(肝內回聲增強)初診為貓脂肪肝的病例。然后，以超聲引導下細針抽吸肝細胞進行細胞學評估，以單位面積≥1/3肝細胞發(fā)生脂肪變性為金標準[8]，共收集37例脂肪肝患貓作為脂肪肝組。

同時，按年齡、性別及體重相近原則，選取同期就診有黃疸癥狀、肝功能指標異常，但肝臟B超檢查未發(fā)現(xiàn)脂肪肝征象的患貓37例作為其他肝病組和健康體檢貓(未有任何臨床癥狀，血液生化指標正常)37例作為健康對照組。

1.2 方法

1.2.1 檢測方法 所有樣本在就診當天采集靜脈血5 mL，1 500 r/min離心10 min，分離出血清。采用全自動血液生化分析儀檢測血清中血糖(Glu)、總蛋白(TP)、三酰甘油(TG)、總膽固醇(Chol)及總膽紅素(TBIL)水平，同時檢測丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)及堿性磷酸酶(ALP)活性。血清β-羥丁酸(BHBA)用酶比色法測定，操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.2.2 治療效果評價 收集所有脂肪肝患貓的治療資料，包括治愈情況、死亡情況、療程等。治愈判定標準為臨床癥狀消退，血液肝功能指標正常，并計算治愈率=治愈數(shù)/總病例數(shù)×100%。

1.2.3 樣本量估算 本研究以受試者工作曲線(ROC曲線)下面積(AUC)為主要指標估算樣本量。假設血清BHBA能有效區(qū)分脂肪肝患貓與非脂肪肝患貓，AUC>0.5。前期預試驗獲知BHBA的AUC為0.7，顯著性水平α=0.05，β=0.1，假陽性率(false positive rate，F(xiàn)PR)取值范圍為0～1.0，組間比例1∶1，采用PASS 16.0軟件估算樣本量。結果表明，至少需要納入脂肪肝患貓33例，對照33例。而本研究納入患貓與兩組對照貓均為37例，滿足研究要求。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理分析 采用SPSS 23.0軟件進行統(tǒng)計學分析。正態(tài)分布的連續(xù)型數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示，非正態(tài)分布連續(xù)型數(shù)據(jù)用中位數(shù)(最小值，最大值)表示。采用ANOVA單因素方差分析事后多重比較LSD進行組間兩兩比較，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗比較組間差異，百分率比較采用卡方檢驗，BHBA與其他指標相關性采用Pearson相關性分析。根據(jù)繪制受試者工作曲線(ROC)來判斷血清BHBA的診斷效能。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結果

2.1 血液生化指標的變化

從表1可以看出，與健康對照組比較，脂肪肝組及其他肝病組的血清TP顯著降低，且低于參考范圍，血清TBIL、ALT、AST及ALP顯著升高(P<0.05)，且高于參考范圍。與其他肝病組比較，脂肪肝組血清TBIL及ALP升高顯著(P<0.05)。脂肪肝組血清Chol水平雖然顯著高于其他肝病組和健康對照組(P<0.05)，但還在參考范圍內。

表1 各組血液生化指標的比較

2.2 血清BHBA水平的變化

脂肪肝患貓血清BHBA水平為1.30 mmol/L±0.65 mmol/L，其他肝病患貓血清BHBA水平為0.47 mmol/L±0.22 mmol/L，健康貓血清BHBA水平為0.38 mmol/L±0.13 mmol/L，脂肪肝組患貓血清BHBA水平極顯著高于其他肝病組和健康對照組(P<0.01)，如圖1A所示。以參考值上限[10](0.5 mmol/L)為閾值，高于閾值定義為BHBA升高，結果發(fā)現(xiàn)脂肪肝組的37例病例中有32例表現(xiàn)為BHBA升高，占比86.48%，極顯著高于其他肝病組(32.43%)和健康對照組(16.22%)P<0.01)，如圖1B所示。

2.3 脂肪肝組血清BHBA與肝功能生化指標的相關性

將脂肪肝組患貓血清BHBA與ALT、AST、ALP及TBIL等指標進行Pearson相關性分析。結果發(fā)現(xiàn)，BHBA與ALP呈現(xiàn)強的正相關關系(r=0.776,P<0.01，圖2C)，與ALT、TBIL呈中等正相關關系(r值分別為0.534、0.503，P<0.01，圖2A、圖2D)，與AST無相關性(r=0.141,P>0.05，圖2B)。

圖2 脂肪肝組血清BHBA與ALT、AST、ALP及TBIL等指標的相關性

2.4 血清BHBA在貓脂肪肝中的診斷效能

ROC曲線下面積(AUC)是反映診斷效能的一個重要指標，AUC越大，診斷可靠性就越強。由圖3可知，BHBA的敏感度為94.6%，特異性為75.7%，截斷值為0.828 mmol/L，AUC為0.923，P<0.01，說明血清BHBA對貓脂肪肝具有較好的診斷價值。

圖3 血清BHBA對貓脂肪肝的ROC曲線圖

F.脂肪肝組；L.其他肝病組；H.健康對照組

2.5 血清BHBA對貓脂肪肝治療結果的影響

以BHBA截斷值0.828 mmol/L為分割點，將37例脂肪肝患貓分成2組，BHBA<0.828 mmol/L組共12例，全部治愈，治愈率為100%，顯著高于BHBA≥0.828 mmol/L組的72.0%(P<0.05)，療程中位數(shù)為7.0 d，顯著低于BHBA≥0.828 mmol/L組的9.5 d(P<0.05)，結果見表2。

表2 不同血清BHBA水平脂肪肝患貓治療效果的比較

3 討論

目前，F(xiàn)HL主要根據(jù)病史、臨床表現(xiàn)、血液生化、臨床病理結果和肝臟超聲表現(xiàn)進行診斷。然而，病史、臨床表現(xiàn)和血液生化檢查對FHL診斷的特異性較差，其他潛在的疾病過程都可能造成混淆。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)HL患貓的病史及臨床表現(xiàn)與其他肝臟疾病相似，血液中ALT、AST及TBIL等肝功指標雖然高于健康貓，但與患有其他肝病貓無差異，也說明目前這些診斷依據(jù)的特異性較差，容易誤診。肝臟超聲檢查可以提高FHL診斷，有研究表明由3名委員會認證的放射科醫(yī)生進行腹部超聲檢查，對FHL診斷的準確率為70%[11-12]，也滿足不了臨床的需求，會出現(xiàn)漏診。最終診斷通常是通過細針抽吸肝細胞進行細胞學評估或通過肝活檢進行組織學評估來做出，存在創(chuàng)傷性，容易出現(xiàn)感染及出血等并發(fā)癥[13]。由此可見，尋找一種對FHL診斷具有靈敏度高、特異性強的診斷標志物十分重要。

負能量平衡被認為是FHL發(fā)生的主要原因[14]。在負能量平衡狀態(tài)下，脂肪組織中大量的甘油三酯被動員分解，產生的游離脂肪酸進入肝臟，在線粒體中進行β-氧化生成乙酰輔酶A，然后乙酰輔酶A可進入三羧酸循環(huán)或合成酮體釋放入血液。酮體是脂肪酸在肝內正常分解代謝的中間產物，包括β-羥丁酸、乙酰乙酸和丙酮，其中含量最多的是β-羥丁酸[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，有86.48%的FHL患貓血液中β-羥丁酸水平高于生理閾值，且脂肪肝組β-羥丁酸水平高于其他肝病患貓和健康貓，這與相關報道在患有FHL的貓中，酮體形成增加的結論相一致[16]。

ROC曲線是反映敏感性和特異性連續(xù)變量的綜合指標，是用構圖法揭示敏感性和特異性的相互關系，以敏感性為縱坐標、(1-特異性)為橫坐標繪制成曲線，曲線下面積越大，診斷準確性越高，因此ROC曲線成為多種疾病診斷性試驗的主要分析方法[17-18]。本研究結果表明，β-羥丁酸對FHL的診斷具有較高的效能(AUC=0.923)，具有良好的敏感性和特異性，說明β-羥丁酸在FHL診斷中具有一定的臨床應用價值。

在本研究中，相對于血β-羥丁酸≥0.828 mmol/L的患貓，血β-羥丁酸<0.828 mmol/L患貓的治愈率明顯提高，療程顯著縮短。因此，血β-羥丁酸水平可指導FHL的臨床治療，對于β-羥丁酸≥0.828 mmol/L的患貓應高度關注，探討能否通過改變治療方案來提高治療效果。

綜上所述，血清β-羥丁酸水平對貓脂肪肝診斷具有一定意義，其水平變化與脂肪肝關系密切。動態(tài)監(jiān)測血清β-羥丁酸水平可作為貓脂肪肝診斷及預后評價的參考指標。