溶血磷脂酸受體1-3在牦牛不同時期卵巢中表達定位

張燕燕，王靖雷，潘陽陽，馬文斌，高麗青，張 輝，李心蕊，余四九，徐庚全

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院/甘肅省牛羊胚胎工程技術(shù)研究中心，甘肅蘭州 730070)

溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid，LPA)的化學(xué)名稱為1-脂酰甘油-3-磷酸酯，是一種最簡單的小分子甘油磷脂，同時也是最有效的水溶性脂質(zhì)信號分子之一。到目前為止，已經(jīng)表明LPA既可以作為磷脂合成的中間體在細胞內(nèi)合成，也可以在細胞外作為細胞間信號分子合成[1]。已在各種生物體液中檢測到LPA的存在，如人和牛血清和血漿、人唾液、腹水、卵泡液、大鼠精漿、牛子宮內(nèi)膜和卵巢黃體細胞[2]，以及人卵巢和宮頸癌細胞。LPA是脂源性G-蛋白藕聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor,GPCR)的激動劑，能促進細胞增殖和分化以及提高細胞與細胞間的相互作用[3]，參與細胞骨架的重新分布以及腫瘤形成和侵襲等多種病理生理過程。

LPA生物學(xué)作用至少由6種高親和力跨膜G蛋白偶聯(lián)受體LPAR1-LPAR6誘導(dǎo)其活性[4]，可能通過核過氧化物酶體增殖物激活受體G[1]。這些膜受體由不同的基因編碼，在人類和小鼠中分為LPAR1-6和Lpar1-6[5]。LPAR在人、牛、羊、豬和嚙齒動物等物種之間顯示出高度的同源性。LPA在人體血清中的濃度10 mmol/L～15 mmol/L[6]，遠遠超過激活LPAR1-5所需的表觀納米分子Kd值[5]，提示LPARs在生理功能中的重要性。還有研究發(fā)現(xiàn)，LPAR在子宮內(nèi)膜中的表達受類固醇激素的調(diào)節(jié)，包括孕酮(progesterone,P4)和雌二醇(estradiol,E2)[7-8]。對卵巢摘除小鼠的研究表明，P4促進了LPAR3的表達，而雌激素則抵消了P4的影響[8]。作者推測P4和E2共同調(diào)節(jié)LPAR3的表達，有助于早孕子宮內(nèi)膜的容受性。在牛的卵丘細胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的LPAR1-4轉(zhuǎn)錄本豐度，而在卵母細胞中，LPAR2的表達高于其他3個LPARs[9]。在綿羊中，Liszewska E等[10]發(fā)現(xiàn)LPAR1-3轉(zhuǎn)錄本在妊娠早期胚胎的滋養(yǎng)外胚層提取物中表達。此外，Van Meeteren L A等[11]在小鼠移植后的第6.5天到第10.5天胚胎發(fā)育過程中發(fā)現(xiàn)4個LPAR的mRNA表達。LPAR通過在器官和組織中的不同分布以及與不同的異三聚體G蛋白的結(jié)合，能夠激活不同的下游信號通路，從而引起基因調(diào)控和LPA誘導(dǎo)的細胞功能的改變[7]。上述研究表明，LPAR在許多哺乳動物生殖生理過程中發(fā)揮著重要的作用，但在牦牛上還未見報道。

牦牛(Bosgrunniens)主要棲息地具有高寒、缺氧、高輻射和植物生長季節(jié)短的環(huán)境特征[12]，是高原畜牧業(yè)的主要畜種，也是我國高寒牧區(qū)的主要經(jīng)濟來源。但是因其生長發(fā)育緩慢，繁殖性能低，是制約當前牦牛業(yè)發(fā)展的重要原因。因此，探究LPA受體在雌性牦牛生殖中的作用，在提高牦牛生產(chǎn)效率和經(jīng)濟效益，促進牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。本試驗以牦牛不同發(fā)情時期卵巢為材料，利用RT-qPCR、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blot)、免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry,IHC)等方法檢測牦牛生殖系統(tǒng)中LPAR1、LPAR2、LPAR3的表達及定位，可為進一步研究牦牛生殖生理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 DAB顯色液、顯/定影液、BeyoEcLPLus液，Beyotime公司產(chǎn)品； Tranzol試劑，北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；TaqPCR Master Mix、Go ScriptTMReverse Transcription System、Wizard?SVd Gel and PCR Clean-Up System，美國Promega公司產(chǎn)品；TB Green?Premix ExTaqTM Ⅱ，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；4×蛋白上樣緩沖液、Western blot所用試劑，索萊寶(北京)有限公司產(chǎn)品、HistostainTM-Plus Kits、Goat Anti-Rab-bit IgG/HRP antibody，Rabbit Anti-LPA1-3 Polyclonal Antibody，北京Bioss公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要儀器 PCR儀(eppendorf),德國艾本德公司；實時熒光定量PCR儀(LightCycler?96 SW 1.1),瑞士Loch1公司產(chǎn)品；陽離子防脫片,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；顯微鏡(DP71),日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.1.3 樣品 2019年11月采自青海省西寧市百德屠宰場，選年齡相近，處于不同繁殖時期(卵泡期,黃體期和妊娠期)的健康成年雌性牦牛(Bosgrunniens)各3頭。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集 牦牛處死后，采集卵泡期(卵巢上見成熟卵泡)、黃體期(見新鮮黃體)同側(cè)，以及妊娠期(見胚胎存在)妊娠側(cè)的卵巢，將采集到的樣品修剪后用9 g/L的生理鹽水沖洗干凈，分成2份，1份液氮保存后送回實驗室，于-80 ℃條件儲存?zhèn)溆?。?份樣品修剪至約1 cm3大小后，于40 mg/mL多聚甲醛溶液中帶回實驗室，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RT-qPCR檢測LPAR1-3基因的表達

1.2.2.1 牦牛不同時期卵巢總RNA提取 參照Trizol試劑盒其說明書將牦牛不同時期卵巢(卵泡期、黃體期、妊娠期)低溫研磨后提取總RNA，利用分光光度計測定RNA濃度和OD260/OD280值，兩步法反轉(zhuǎn)錄(Go ScriptT M Reverse Tran-scription Syatem,Promega)合成cDNA，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.2LPAR1-3基因相對表達量檢測 根據(jù)GenBank公布的普通牛LPAR1、LPAR2、LPAR3基因編碼區(qū)，在NCBI Primer-Blast中設(shè)計，試驗選擇β-actin(肌動蛋白)為內(nèi)參基因，本試驗所涉及引物均由生工生物工程(上海)有限公司合成，具體引物信息見表1。

表1 目的基因和內(nèi)參基因引物序列

利用實時熒光定量PCR檢測LPAR1、LPAR2、LPAR3基因在牦牛不同時期卵巢中的表達情況。PCR總反應(yīng)體系20 μL：TB Green?Premix ExTaqTMⅡ 10μL，無菌去離子水6.4 μL，cDNA(500 ng/μL) 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95℃ 5s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 10 s，共40個循環(huán)。LightCycler/LightCy-cler480 System(Roche Diagnostics,德國)，每組重復(fù)4次(n=4)。根據(jù)實時熒光定量熔解曲線判斷引物特異性，根據(jù)每個樣品的Cq值，經(jīng)2-ΔΔCq計算LPAR1、LPAR2、LPAR3基因在牦牛不同時期卵巢中的相對表達量。

1.2.3 Western blot檢測LPAR1-3蛋白的表達

1.2.3.1 制備牦牛組織蛋白質(zhì)樣品 將牦牛不同時期卵巢組織樣品低溫研磨碎后，稱取一定量加入蛋白裂解液(按裂解液(radio immunoprecipita-tion assa,RIPA)∶蛋白酶抑制劑(phenylmethanesul-fonyl fluoride,PMSF)= 100∶1配制)冰上反應(yīng)，待組織充分裂解后 4 ℃、12 000 r/min離心5 min，吸出上清液，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 Western blot 將蛋白樣品與4×蛋白上樣緩沖液按3∶1混合，100 ℃ 10 min金屬浴變性后-20 ℃保存用于后續(xù)試驗。SDS-PAGE凝膠電泳，LPAR1、LPAR3配制80 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠，LPAR2配制100 g/L和50 g/L濃縮膠，變性蛋白經(jīng)電泳分離后，根據(jù)LPAR蛋白大小(LPAR1：41 ku，LPAR2：39 ku，LPAR3:39 ku)切膠，轉(zhuǎn)至PVDF膜(polyvinylidene fluoride)上，LPAR1在4 ℃的冰箱用50 g/L脫脂奶粉封閉7 h；LPAR2在常溫用50 g/L脫脂奶粉封閉2 h；LPAR3在4 ℃的冰箱用50 g/L脫脂奶粉封閉過夜(12 h)；一抗Rabbit Anti-LPA1 Polyclonal Antibody (1∶600稀釋)中4 ℃孵育過夜；一抗Rabbit Anti-LPA2 Polyclonal Antibody (1∶1 000稀釋)中4 ℃孵育過夜；一抗Rabbit Anti-LPA3 Polyclonal Antibody (1∶1 200稀釋)中4 ℃孵育過夜，PBST(磷酸鹽緩沖液(PBS)+Tween 20)浸洗30 min后，二抗Goat Anti-Rabbit IgG/HRP antibody (1∶1 000稀釋)中室溫孵育40 min；PBST浸洗膜3次，每次20 min。在膜上滴加電化學(xué)發(fā)光液(elec-tro-chemi- luminescence,ECL)，GEAI600成像系統(tǒng)掃描目的條帶，利用Image J分析灰度值，計算蛋白相對表達量(目的灰度數(shù)值/內(nèi)參灰度數(shù)值)。

1.2.4 免疫組化法對LPA受體蛋白分布進行定位 選取用固定后的卵巢組織塊，上行酒精脫水，石蠟包埋，切片，下行脫蠟后進行抗原修復(fù)，在檸檬酸鹽緩沖液中熱誘導(dǎo)，高火煮沸后轉(zhuǎn)中火10 min，室溫自然冷卻。參照Histostai TM-Plus Kits試劑盒說明，滴加30 mL/L H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，37 ℃作用10 min；將組織周圍擦干后滴加封閉液(A液)減少非特異性背景，室溫濕盒孵育15 min；滴加一抗Rabbit Anti-LPA1-3 Polyclonal Antibody (1∶500稀釋)，添加對照組(PBS代替一抗)，4 ℃濕盒孵育過夜；滴加二抗(B液)，37 ℃濕盒孵育10 min；滴加C液，37 ℃溫箱濕盒孵育15 min；加二氨基聯(lián)苯胺顯色液(diaminob-enzidine,DAB)顯色，蘇木精復(fù)染90 s、脫水、透明、樹脂封片，室溫晾干后Olympus(DP71)拍照系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 LPAR1-3基因檢測結(jié)果

通過RT-qPCR檢測LPAR1、LPAR2、LPAR3在不同時期卵巢中的表達結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，LPAR1-3基因在不同時期卵巢中均有表達(圖1)，在不同時期卵巢中,LPAR1基因在卵泡期卵巢中的表達量顯著高于黃體期和妊娠期(P<0.05)，黃體期和妊娠期表達量相似(圖1A)；LPAR2在卵泡期卵巢中的表達量最高，顯著高于黃體期(P<0.05),妊娠期的表達量最低(圖1B)；LPAR3在黃體期卵巢中表達量最高，顯著高于卵泡期(P<0.05),妊娠期的表達量最低(圖1C),在同一時期卵巢中：LPAR1在卵泡期、黃體期、妊娠期的表達量均顯著高于LPAR2和LPAR3(P<0.05)；其中，LPAR3在卵泡期表達量最低(圖1D)，LPAR2在黃體期和妊娠期的表達量均最低(圖1E和圖1F)。結(jié)果說明LPAR1-3在不同繁殖時期牦牛卵巢中的表達存在差異。

2.2 LPAR1-3蛋白檢測結(jié)果

通過Western blot檢測LPAR1、LPAR2、LPAR3蛋白在不同時期卵巢中的表達結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，LPAR1-3蛋白在不同時期卵巢中均有表達(圖2)，在不同時期卵巢中, LPAR1、LPAR2、LPAR3蛋白的表達量均在妊娠期最高，均顯著高于黃體期(P<0.05)，并且在卵泡期表達量均最低(圖3A、B、C)。在同一時期卵巢中,LPAR3蛋白在卵泡期、黃體期、妊娠期的表達量均顯著高于LPAR1和LPAR2(P<0.05)，LPAR2的表達量最低(圖D3、E、F)。結(jié)果說明LPAR1-3蛋白在不同繁殖時期牦牛卵巢中的表達存在差異，且在各個時期中LPAR3表達量最高。

內(nèi)參基因：β-actin；n=4。A.LPAR1；B.LPAR2；C.LPAR3；D.卵泡期；E.黃體期；F.妊娠期；不同字母代表差異顯著(P<0.05)

1.卵泡期；2.黃體期；3.妊娠期

2.3 LPAR1-3蛋白定位檢測結(jié)果

免疫組織化學(xué)染色結(jié)果中呈棕褐色的為陽性表達，與之對應(yīng)的是陰性對照(圖4)。結(jié)果顯示，LPAR1、LPAR2、LPAR3蛋白在牦牛不同時期卵巢上均有表達，LPAR1-3在卵泡期卵巢上的表達主要分布在卵泡顆粒層(SG)、卵泡膜(TF)、生殖上皮(GE)、卵泡液(FF)；LPAR1-3在黃體期卵巢上的表達主要在黃體細胞(CL)、生殖上皮(GE)；LPAR1-3在妊娠期期卵巢上的表達主要在卵泡顆粒層(SG)、卵泡膜(TF)、黃體細胞(CL)、生殖上皮(GE)、卵泡液(FF)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，不同時期卵巢中LPAR1、LPAR2、LPAR3的mRNA和蛋白豐度不存在相關(guān)性。轉(zhuǎn)錄和翻譯遠不是線性的、簡單的關(guān)系。據(jù)報道，調(diào)節(jié)蛋白通過在與SD序列相鄰的區(qū)域與其自身的mRNA結(jié)合來抑制某些順反子的翻譯[13]。同時，SD序列還決定翻譯效率，具有較少SD序列的轉(zhuǎn)錄本翻譯效率較低，翻譯效率會顯著改變部分基因mRNA與蛋白質(zhì)的相關(guān)性[14]。同時研究人員在不同的機制中發(fā)現(xiàn)，sRNA會影響mRNA的翻譯效率和穩(wěn)定性，有些促進核糖體與靶mRNA結(jié)合，有些則阻止翻譯[15]、影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性或翻譯水平進而導(dǎo)致mRNA和蛋白量無相關(guān)性[16]。此外，Liszewska E等[10]發(fā)現(xiàn)在綿羊滋養(yǎng)外胚層中LPAR1和LPAR3的mRNA豐度在第14天達到高峰，而這兩種LPAR的蛋白水平在妊娠第17天達到最高，先前報道的綿羊胚胎滋養(yǎng)外胚層分泌的主要產(chǎn)物即干擾素，在蛋白表達高峰和轉(zhuǎn)錄物之間有相似的時間間隔。胚胎干擾素mRNA在第14天最豐富，而干擾素蛋白在第16～第18天達到最高水平，幾乎檢測不到RNA。說明干擾素可能在一定程度上影響mRNA和蛋白量的相關(guān)性[17]。綜上所述，轉(zhuǎn)錄和翻譯涉及順式作用機制和反式作用機制的不同機制產(chǎn)生了大量的系統(tǒng)，這些系統(tǒng)可以促進或抑制從一定數(shù)量的mRNA分子合成蛋白質(zhì)。此外，不同時期卵巢中LPAR的mRNA和蛋白表達可能受到某種因子的調(diào)控作用。

內(nèi)參蛋白：β-actin；n=4。A.LPAR1；B.LPAR2；C.LPAR3；D.卵泡期；E.黃體期；F.妊娠期；不同字母代表差異顯著(P<0.05)

卵巢是雌性動物的主要生殖器官，不僅產(chǎn)生卵子和排卵，還可以產(chǎn)生性激素(包括雌激素、孕激素和少量的雄性激素)以及分泌一些多肽激素和生長因子，在生殖器官上占有主導(dǎo)作用。本研究結(jié)果顯示LPAR1-3在牦牛的不同時期的卵巢上均有表達。主要分布在卵巢生殖上皮、顆粒細胞、卵泡液、卵泡膜和黃體細胞。Chen S U等[18]發(fā)現(xiàn)LPAR1-3受體在人顆粒黃體細胞中表達，并且有文獻報道在牛卵巢中的黃體[2]和卵泡顆粒細胞[19]中檢測到4種LPAR的表達。此外，在從接受體外受精的婦女的卵泡液中也發(fā)現(xiàn)了LPA[20]，與本試驗結(jié)果一致。在牛體中，顆粒細胞是E2的主要來源和靶點[21-23]，膜來源的雄烯二酮(A4)在類固醇脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為E2[22]。此外，LPA也可刺激E2的產(chǎn)生，E2是通過調(diào)節(jié)類固醇的產(chǎn)生和促性腺激素受體的表達來促進卵泡發(fā)育[22]。本試驗結(jié)果顯示，LPAR1-3在卵泡顆粒層和卵泡膜表達，可能與LPAR1-3參與卵巢上皮前體顆粒細胞增殖和分化有關(guān)，提示LPAR1-3可能通過調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和卵泡閉鎖過程影響牦牛生育能力。有研究表明，補充LPA的體外成熟培養(yǎng)液可以提高卵母細胞的成熟率[23]。此外，在LPA存在下，豬和牛卵母細胞的成熟率也有不同程度的提高[24]。本試驗結(jié)果顯示，LPAR1-3在卵巢的卵泡液中表達，可能與參與卵母細胞成熟和功能的調(diào)控作用有關(guān)。有報道稱，LPA通過增加3b-羥基類固醇脫氫酶/5D-4D異構(gòu)酶在牛黃體類固醇生成細胞中的表達來刺激P4的合成[2]，P4是一種天然孕激素，促進子宮內(nèi)膜分泌，以利受精卵的植入，并降低子宮內(nèi)膜的興奮性，保證妊娠的安全進行。本研究發(fā)現(xiàn)，LPAR1-3在卵泡液中均表達，推測LPAR1-3可能參與牦牛胚胎植入和妊娠的維持。

卵泡的正常生長、發(fā)育和成熟是提高繁殖力的關(guān)鍵。有研究發(fā)現(xiàn)，LPA可通過LPA受體誘導(dǎo)白介素細胞8(interleukin-8,IL-8)和白介素細胞6(interleukin-6,IL-6)的表達[18]。IL-8和IL-6已被發(fā)現(xiàn)在排卵前卵泡中升高，并與排卵有關(guān)。IL-8和IL-6可能具有白細胞對中性粒細胞和單核細胞的趨化活性，這可能通過蛋白水解因子的釋放導(dǎo)致卵泡破裂時的組織降解[25]。此外，IL-8參與卵泡發(fā)育、排卵、類固醇生成和黃體功能。本試驗結(jié)果顯示，卵泡期LPAR1-3均表達，且LPAR3顯著高于LPAR1、LPAR2，因此，卵泡期卵巢中LPAR1-3的存在可能在牦牛卵泡的生長發(fā)育以及排卵中起一定的作用。

黃體是一種在卵巢中暫時形成的內(nèi)分泌腺，在發(fā)情周期結(jié)束時經(jīng)歷退化。黃體由成熟卵泡形成，生長迅速，血管化迅速。牛黃體由大小黃體細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和免疫細胞組成。在未懷孕的奶牛中，黃體在排卵后17 d～18 d左右經(jīng)歷黃體溶解并失去功能[26]。黃體生成高峰和排卵后，黃體顆粒細胞和卵泡膜細胞形成黃體新生血管[27]。新生血管可能促進類固醇激素的生物合成和運輸。有報道稱，LPAR1參與了LPA誘導(dǎo)的IL-8蛋白在血管生成中內(nèi)皮細胞的遷移、通透性、管形成和增殖的過程。而LPAR2參與了LPA誘導(dǎo)的IL-6蛋白在功能上增強了內(nèi)皮細胞的通透性[18]。綜上所述，LPAR1、LPAR2可能在LPA的誘導(dǎo)下參與牦牛黃體新生血管的形成。

妊娠期卵巢會稍微有所增大，同時停止排卵，一側(cè)卵巢可以看到有妊娠黃體的形成，妊娠黃體是用來合成雌激素和孕激素的。黃體在妊娠期間的主要功能是合成P4，它在調(diào)節(jié)受精后胚泡的植入中起主要作用。本試驗結(jié)果顯示，LPAR1-3在妊娠期卵巢均表達，可能與LPAR1-3參與調(diào)節(jié)受精后胚泡的植入有關(guān)。在摘除卵巢的小鼠中P4也促進了LPAR3的表達，而雌激素則抵消了P4的影響[8]，作者推測P4和E2共同調(diào)節(jié)LPAR3的表達，有助于早孕子宮內(nèi)膜的容受性。此外，Ye X等[28]發(fā)現(xiàn)LPAR3在小鼠子宮中的表達與正確的胚胎植入有關(guān)。本試驗結(jié)果顯示，LPAR3在妊娠期表達量顯著高于LPAR1和LPAR2,LPAR3可能通過P4促進子宮內(nèi)膜分泌，并降低子宮內(nèi)膜的興奮性，保證妊娠的安全進行,提示LPAR3可能在牦牛的胚胎的植入和妊娠的維持具有一定的作用。