不同前處理方法對(duì)山藥中13種真菌毒素檢測(cè)的影響

◎ 黎思樂(lè)，趙美平，容 順，陳 維，梁達(dá)清，李詞周，郭偉鵬

（1.廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測(cè)中心，華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物安全與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510000；2.廣州王老吉大健康產(chǎn)業(yè)有限公司，廣東 廣州 510000）

真菌廣泛存在于空氣、水、土壤等自然環(huán)境中，在環(huán)境條件適宜時(shí)，如溫濕度過(guò)高，產(chǎn)毒真菌可大量繁殖。真菌產(chǎn)生的有害物質(zhì)稱(chēng)為真菌毒素。常見(jiàn)的真菌毒素有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素、伏馬毒素、T-2毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、桔青霉素和雜色曲霉素，這些毒素的結(jié)構(gòu)式及其危害具體見(jiàn)表1。

表1 真菌毒素結(jié)構(gòu)式與危害表

山藥，生活中最常見(jiàn)“藥食同源”藥材之一，富含淀粉、多糖、腺苷、環(huán)肽類(lèi)和微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)成分，所以在栽培、采收、加工和分裝運(yùn)輸過(guò)程中，如果存儲(chǔ)條件不佳，容易受到各種產(chǎn)毒真菌及真菌毒素的污染。本文以山藥為樣品，通過(guò)優(yōu)化前處理步驟，建立了高效、簡(jiǎn)潔的多種真菌毒素檢測(cè)方法。

續(xù)表1

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

13種毒素標(biāo)準(zhǔn)品：黃曲霉毒素AFB1、AFB2、AFG1、AFG2；赭曲霉毒素OTA；嘔吐毒素DON；玉米赤霉烯酮F-2；T-2毒素；桔青霉素CIT；雜色曲霉毒素ST；伏馬毒素FB1、FB2、FB3；均購(gòu)自青島普瑞邦生物工程有限公司。Pribolab試劑為甲醇、乙腈、甲酸，均為色譜純，購(gòu)自上海安譜公司。超純水，實(shí)驗(yàn)室一級(jí)水，由Millipore超純水機(jī)制備。

1.2 儀器與設(shè)備

UPLC-MS/MS超高效液相色譜-質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源：SCIEX Triple Quad 5500+；QT-1渦旋混合器：上海琪特分析儀器有限公司；多功能自動(dòng)樣品濃縮儀：Biotage；BSA224S-CW電子分析天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；KDC-40低速離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；EYELA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛(ài)朗儀器有限公司；氮吹儀：TurboVap。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

山藥樣品用粉碎機(jī)粉粹，稱(chēng)取山藥樣品2.5 g于50 mL離心管中，加入5 mL甲醇/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸溶液，渦旋混勻1 min，超聲20 min，在低速離心機(jī)以5 000 r·min-1離心5 min。上清液移去另一離心管，再加入5 mL乙腈/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸溶液，重復(fù)前面步驟進(jìn)行提取，合并2次上清液。取上清液5 mL，40 ℃水浴下，氮吹濃縮至近干，加入甲醇/水（50/50，V/V）定容2 mL，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，待測(cè)。

1.3.2 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

按1.3.1處理，獲得空白樣品液，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)稀釋不同濃度。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18柱（Waters，1.6 μm×2.1 mm×100 mm）；流速：0.4 mL·min-1；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL，分析總時(shí)間10 min；流動(dòng)相A：0.1%甲酸-0.5%乙酸銨，流動(dòng)相B：甲醇；UPLC-MS/MS梯度洗脫條件：0～ 0.5 min，95%A，5%B；0.5～ 5 min，10%A，90%B；5.01～8 min，10%A，90%B；8.01～10 min，95%A，5%B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜檢測(cè)采用電噴霧離子源（ESI），檢測(cè)模式為多反應(yīng)檢測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM），13種真菌毒素質(zhì)譜采集參數(shù)見(jiàn)表2，MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 13種真菌毒素的質(zhì)譜采集參數(shù)表

圖1 13種真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液-MRM譜圖

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

合適的提取溶劑不僅能減少樣品中的雜質(zhì)如脂肪和蛋白質(zhì)等，降低基質(zhì)效應(yīng)，還可以提高回收率。樣品提取一般采用有機(jī)溶劑加水作為溶劑，提取液含水可以濕潤(rùn)基質(zhì)，增強(qiáng)有機(jī)溶劑的滲透能力[3]。不同毒素性質(zhì)各有差異，如伏馬毒素，它屬于水溶性真菌毒素，在提取溶劑中加入一定比例的水，可有效地提取水溶性真菌毒素。

考察不同有機(jī)溶劑比例、酸堿度對(duì)13種真菌毒素的提取效果。第一組5種提取液和回收率見(jiàn)圖2，當(dāng)采用單一溶劑“甲醇/水”提取時(shí)，黃曲霉毒素回收率均小于65%，其他毒素采用甲醇/水時(shí)，回收率基本在60%～125%。當(dāng)采用單一溶劑“乙腈/水”提取時(shí)，黃曲霉毒素回收率基本在60%～75%，其他毒素回收率均在70%～120%。所以兩種有機(jī)溶劑中，乙腈/水的提取效果優(yōu)于甲醇/水。而采用單一溶劑乙腈/水（80/20，V/V）提取和混合溶劑提取時(shí)，2種提取溶劑的回收率比較接近，雖都滿足要求，但黃曲霉毒素回收率還是相對(duì)偏低。因黃曲霉毒素在中性或弱酸性溶液中穩(wěn)定，第二組在提取液中加入0.1%甲酸，考察酸堿度對(duì)13種毒素提取效果和穩(wěn)定性。第二組結(jié)果見(jiàn)圖3，13種真菌毒素的回收率均略有提高，尤其回收率偏低的黃曲霉毒素。

圖2 不同提取溶劑加標(biāo)回收率對(duì)比圖

圖3 未加甲酸提取溶劑與加0.1%甲酸提取溶劑的回收率對(duì)比圖

因此本實(shí)驗(yàn)選擇混合溶液（第一次甲醇/水（80/20，V/V），0.1% 甲 酸； 第 二 次 乙 腈 /水（80/20，V/V）-0.1%甲酸）作為提取溶劑。

2.2 濃縮方式的優(yōu)化

前處理過(guò)程中濃縮也可能存在損失，常見(jiàn)方法有旋蒸和氮吹，通過(guò)樣品加標(biāo)回收率考察各自的損失情況。結(jié)果如圖4所示，通過(guò)氮吹方式濃縮的回收率明顯高于旋蒸方式，所以前處理濃縮步驟優(yōu)先選擇氮吹方式。

圖4 不同濃縮方式樣品加標(biāo)回收率對(duì)比圖

2.3 基質(zhì)效應(yīng)

除前處理步驟，必須考慮另外一個(gè)影響因素——基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng)是除分析物外的其他成分，其會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響，有增強(qiáng)或抑制作用[4]。樣品中的基質(zhì)如脂肪、蛋白質(zhì)、色素對(duì)分析物測(cè)定有干擾，直接干擾分析物在檢測(cè)器中的響應(yīng)[5]。

基質(zhì)效應(yīng)（SSE,%）=空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率/純?nèi)軇?biāo)準(zhǔn)曲線的斜率×100[5]。該比值代表了干擾物對(duì)目標(biāo)物離子化效率的影響。SSE為80%～120%為基質(zhì)不明顯；SSE＜80%為基質(zhì)抑制效應(yīng)；SSE＞120%為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[6]。通過(guò)表3可知，山藥中只有F-2、ST、T-2的SSE在80%～120%，所以基質(zhì)效應(yīng)不算明顯；OTA、CIT、FB的都大于120%，對(duì)樣品有增強(qiáng)效應(yīng)；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON的都＜65%，對(duì)樣品有明顯抑制效果?，F(xiàn)在解決基質(zhì)效應(yīng)的方法主要有兩個(gè)：使用合適的內(nèi)標(biāo)和采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正[6]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)配制基質(zhì)校正曲線，用其定量樣品，可以補(bǔ)償其基質(zhì)效應(yīng)[7]。

表3 13種真菌毒素的信號(hào)抑制/增強(qiáng)效應(yīng)表

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢測(cè)限、定量限

13種真菌毒素響應(yīng)值有差異，所以其線性范圍有區(qū)別。按建立的樣品預(yù)處理方法制備空白基質(zhì)溶液，配制基質(zhì)校正曲線，除CIT、FB、DON 3種真菌毒素外，其他毒素曲線濃度 0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1和 20 ng·mL-1，CIT 曲 線 濃 度1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1和 100 ng·mL-1；FB 曲線濃度 0.5 ng·mL-1、1 ng·mL-1、5 ng·mL-1、10 ng·mL-1、20 ng·mL-1和 50 ng·mL-1；DON 曲線濃度 10 ng·mL-1、20 ng·mL-1、50 ng·mL-1、100 ng·mL-1、150 ng·mL-1和 200 ng·mL-1。 按 1.3.4 和1.3.5色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，以待測(cè)物色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X，ng·mL-1）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限如表4所示，各種真菌毒素相關(guān)系數(shù)（R）均大于0.997，線性關(guān)系良好。

表4 13種真菌毒素的線性范圍、檢測(cè)限和定量限表

2.4.2 準(zhǔn)確度和精密度

實(shí)驗(yàn)采用樣品加標(biāo)回收率方式檢驗(yàn)其準(zhǔn)確度和精密度。選取3個(gè)低、中、高加標(biāo)濃度，添加標(biāo)準(zhǔn)品溶液到空白樣品中，每個(gè)濃度進(jìn)行3平行測(cè)定。按確定好實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。準(zhǔn)確度和精密度結(jié)果見(jiàn)表5，黃曲霉毒素在3個(gè)加標(biāo)濃度的回收率在69.3%～85.6%，相對(duì)偏差RSD為0.6%～7.4%；其他12種加標(biāo)濃度的回收率在70.1%～112.4%，相對(duì)偏差RSD為0.7%～7.2%，回收率良好，可滿足山藥中真菌毒素的檢測(cè)要求。

表5 13種真菌毒素的方法回收率和RSD表

2.4.3 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從廣州市市區(qū)不同類(lèi)型超市隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)山藥干10批次。通過(guò)建立的方法對(duì)10批山藥進(jìn)行13種真菌毒素檢測(cè)，結(jié)果均小于食品標(biāo)準(zhǔn)的檢出限，未檢出。

3 結(jié)論

本文以山藥為樣品，經(jīng)過(guò)優(yōu)化提取溶劑、濃縮方式，最終實(shí)驗(yàn)確定提取溶劑為甲醇/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸、乙腈/水（80/20，V/V）-0.1%甲酸混合提取液，氮吹方式進(jìn)行濃縮?；|(zhì)效應(yīng)分析可知，部分真菌毒素在山藥中有增強(qiáng)或抑制作用的基質(zhì)效應(yīng)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇用空白山藥基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此來(lái)補(bǔ)償標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液中標(biāo)物的響應(yīng)。

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，線性、準(zhǔn)確度、精密度均符合實(shí)驗(yàn)要求，證明該方法前處理能快速實(shí)現(xiàn)13種真菌毒素測(cè)定。從廣州市區(qū)不同類(lèi)型的超市隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)山藥干10批次進(jìn)行13種真菌毒素檢測(cè)，均小于食品標(biāo)準(zhǔn)的檢出限，結(jié)果均未檢出。