柱花草磷饑餓響應(yīng)基因SgPHR1和SgPHR2的克隆與表達(dá)分析

黃杰 宋劍靈 安娜 鄒曉燕 李季膚 劉國(guó)道 陳志堅(jiān)

摘 ?要：低磷脅迫是限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要因素之一。磷饑餓響應(yīng)因子PHR（phosphate starvation response）是植物磷信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵因子，具有調(diào)控植物磷平衡的生物學(xué)功能。本研究在柱花草（Stylosanthes guianensis）中克隆到轉(zhuǎn)錄因子SgPHR1和SgPHR2基因。SgPHR1和SgPHR2基因cDNA全長(zhǎng)分別為1413?bp和849?bp，編碼470和282個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量分別為51.4?kD和30.9?kD。SgPHR1和SgPHR2均為SANT家族成員，包含MYB蛋白結(jié)構(gòu)域和CC蛋白結(jié)構(gòu)域，并具有多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)。亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)表明，SgPHR1和SgPHR2均定位于細(xì)胞核中。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，SgPHR1基因在柱花草根和葉中的表達(dá)量高于莖中的表達(dá)量，而SgPHR2基因在葉中表達(dá)量顯著高于根和莖。缺磷（-P）和缺氮（-N）處理均顯著增強(qiáng)了SgPHR1和SgPHR2在柱花草根中的表達(dá)。不同缺磷時(shí)間處理結(jié)果進(jìn)一步表明了SgPHR1和SgPHR2在轉(zhuǎn)錄水平上響應(yīng)低磷脅迫，暗示SgPHR1和SgPHR2可能參與了柱花草對(duì)低磷脅迫的應(yīng)答。本研究結(jié)果為解析柱花草響應(yīng)低磷脅迫的分子機(jī)制提供了候選基因。

關(guān)鍵詞：低磷脅迫;柱花草;PHR;基因表達(dá);轉(zhuǎn)錄因子

Abstract： Low phosphorus （P） stress is one of the constraints limiting crop growth and yield. PHR （phosphate starvation response） is the key factor in P signaling network， regulating plant phosphate （Pi） homeostasis. In this study， two transcription factors， SgPHR1 and SgPHR2， were cloned in stylo （Stylosanthes guianensis）. The full length of SgPHR1 and SgPHR2 was 1413?bp and 849?bp， encoding 470 and 282 amino acid residues， respectively. The protein molecular weight of SgPHR1 and SgPHR2 was 51.4?kD and 30.9?kD， respectively. Both SgPHR1 and SgPHR2 belonged to the SANT family and contained MYB protein domain and CC protein domain. Both SgPHR1 and SgPHR2 included a set of potential phosphorylation sites. Subcellular localization prediction indicated that both SgPHR1 and SgPHR2 localized to the nucleus. Real-time quantitative PCR results showed that the transcript of SgPHR1 in leaves and roots was higher than that in stems， while SgPHR2 exhibited the highest expression in leaves. Furthermore， the expression of SgPHR1 and SgPHR2 was up-regulated by both -P and nitrogen （-N） deficient treatments in stylo roots. The transcription level of SgPHR1 and SgPHR2 was found to be increased during -P treatments， suggesting that SgPHR1 and SgPHR2 involved in stylo response to Pi starvation. This study would provide candidate genes for investigating the mechanism of stylo response to P deficiency.

Keywords： low phosphorus stress; Stylosanthes; phosphate starvation response; gene expression; transcription factor

磷（phosphorus，P）是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，參與植物多種生理生化過(guò)程，如光合作用、能量和脂類代謝等[1-3]。然而，土壤磷的有效性低，特別是在酸性土壤中，磷容易被鋁（Al）和鐵（Fe）等金屬元素結(jié)合形成不能被植物直接吸收和利用的難溶性磷[4-5]。因此，低磷脅迫是酸性土壤上限制作物生長(zhǎng)和產(chǎn)量的重要因素之一[6]。在低磷環(huán)境下，植物表現(xiàn)出植株矮小，生長(zhǎng)緩慢，葉色暗綠和根系發(fā)育受阻等脅迫癥狀[7]。為應(yīng)對(duì)低磷脅迫，植物形成了一系列的適應(yīng)性機(jī)制，如植物可以通過(guò)改變根系形態(tài)和構(gòu)型增加對(duì)土壤磷的吸收[8-9];通過(guò)分泌有機(jī)酸和酸性磷酸酶來(lái)活化利用土壤難溶性磷和有機(jī)磷[10-12];通過(guò)誘導(dǎo)磷轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)增強(qiáng)對(duì)磷的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)[13]。另外，磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在維持植物細(xì)胞磷平衡中具有重要調(diào)控作用[14-15]。

磷饑餓響應(yīng)因子（phosphate starvation response，PHR）屬于MYB-CC型轉(zhuǎn)錄因子，在磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[16]。PHR具有Myb DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，C端具有卷曲螺旋（CC）結(jié)構(gòu)域。PHR一般定位于細(xì)胞核，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控的作用，能調(diào)控下游磷饑餓響應(yīng)基因的表達(dá)，如PT、PHT和MIR399等[17]。在低磷條件下，PHR會(huì)形成二聚體，通過(guò)CC結(jié)構(gòu)域結(jié)合在磷饑餓響應(yīng)基因啟動(dòng)子P1BS（GNATATNC）順式作用元件上，從而調(diào)控靶基因表達(dá)[16]。綠色衣藻（Algachamycary）CrPSR1是最早發(fā)現(xiàn)的MYB-CC型轉(zhuǎn)錄因子，其在調(diào)節(jié)綠色衣藻響應(yīng)低磷脅迫中起作用[17]。AtPHR1是擬南芥（Arabidopsis thaliana）磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)因子，其可通過(guò)調(diào)控PT等下游基因表達(dá)響應(yīng)低磷環(huán)境[18-19]。近年來(lái)，在水稻（Oryza sativa）[20]、玉米（Zea mays）[21]、大豆（Glycine max）[22]和菜豆（Phaseolus vulgaris）[23]等植物中相繼克隆并鑒定了PHR同源基因，暗示PHR在植物適應(yīng)低磷脅迫中起重要作用。

柱花草（Stylosanthes spp.）原產(chǎn)于美洲和非洲熱帶和亞熱帶地區(qū)，是重要的熱帶豆科牧草[24]。柱花草廣泛用于牧草飼料和綠肥覆蓋等方面。柱花草具有良好的適應(yīng)低磷酸性土壤的能力，其被認(rèn)為是研究植物適應(yīng)酸性土壤低磷脅迫的重要熱帶豆科植物。迄今為止，已從柱花草中克隆了一系列低磷響應(yīng)基因，如SgPT1、SgPAP7/10/23/26和SgSPX1[25-27]，但是，對(duì)柱花草磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控因子基因的克隆和研究較少。因此，本研究克隆了柱花草2個(gè)磷饑餓響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子基因SgPHR1和SgPHR2，并對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行了生物信息學(xué)和基因表達(dá)分析，可為進(jìn)一步解析柱花草適應(yīng)低磷脅迫的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供基因資源。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

本研究所用的實(shí)驗(yàn)材料為‘熱研2號(hào)圭亞那柱花草（Stylosanthes guianensis）。柱花草種子由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所草業(yè)研究中心提供。

1.2 ?方法

1.2.1 ?材料與處理 ?柱花草種子去種皮后于80?℃水浴3?min，在濕潤(rùn)的濾紙上萌發(fā)2?d。將萌發(fā)后的柱花草幼苗移到1/2 Hoagland營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行正常培養(yǎng)。柱花草培養(yǎng)14?d后，進(jìn)行不同磷濃度處理，分別為0.5?μmol/L KH2PO4（低磷，LP）和250?μmol/L KH2PO4（正常磷，CK）。處理14?d后收獲樣品，測(cè)定生物量和磷含量。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。

1.2.2 ?磷含量測(cè)定 ?柱花草樣品置于105?℃殺青30?min，75?℃烘干至恒重。將樣品粉碎后，稱取0.07?g樣品，在馬弗爐中600?℃灰化10?h，然后采用鉬銻抗顯色法測(cè)定植株磷含量。

1.2.3 ?RNA提取和cDNA合成 ?總RNA提取參考TRIzol Universal提取試劑（Tiangen，中國(guó)）說(shuō)明書。稱取0.1?g根系樣品，加入1?mL TRIzol提取液充分研磨并在室溫放置5?min。4?℃，12 000?r/min離心3?min，吸取上清液至1.5?mL離心管中，加入預(yù)冷的5?mol/L氯化鈉和氯仿，充分混勻。4?℃，12 000?r/min離心10?min，取上清液，加入等體積的異丙醇，充分混勻，室溫放置10?min。4?℃，12 000?r/min離心10?min，棄上清液，加入1?mL 75%乙醇。4?℃，7500?r/min離心5?min，棄上清液，風(fēng)干沉淀，加入無(wú)RNase ddH2O充分溶解RNA。

參考RevertAid First Strand cDNA Synthesis試劑盒（Thermo Fisher，美國(guó)）方法合成cDNA第一鏈。在PCR管中加入2?μg RNA、1?μL Oligo （dT）18，并加入無(wú)RNase ddH2O至12?μL。于65?℃反應(yīng)5?min后，加入4?μL 5×Reaction Buffer、2?μL dNTP Mix、1?μL RNase Inhibitor和1?μL RevertAid M-MuL V Reverse transcriptase。反應(yīng)混合物于42?℃反應(yīng)60?min，70?℃反應(yīng)5?min。反應(yīng)結(jié)束后，cDNA樣品于–20?℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 ?SgPHR1和SgPHR2全長(zhǎng)克隆 ?基于本課題組柱花草根系低磷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果，篩選獲得SgPHR1和SgPHR2基因全長(zhǎng)序列，根據(jù)序列設(shè)計(jì)SgPHR1-ORF-F/R和SgPHR2-ORF-F/R引物（表1）。以根系cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增SgPHR1和SgPHR2基因?；厥誔CR產(chǎn)物并連接到克隆載體pMD18-T（TaKaRa，日本），進(jìn)一步轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α并進(jìn)行測(cè)序分析，獲得SgPHR1和SgPHR2全長(zhǎng)序列。

1.2.5 ?生物信息學(xué)分析 ?利用KinasePhos（http：//kinasephos.mbc.nctu.edu.tw/）進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè);利用WoLF PSORT（https：//www.genscript. com/ wolf-psort.html）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)分析;運(yùn)用ClustalX1.8進(jìn)行多序列比對(duì)分析;采用MAGA-X構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）網(wǎng)站進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析。

1.2.6 ?實(shí)時(shí)定量PCR分析 ?使用QuantStudioTM Real-Time PCR（Thermo Fisher，美國(guó)）系統(tǒng)和SYBR Green（Vazyme，中國(guó)）定量試劑盒，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR分析。定量PCR反應(yīng)體系為10?μL 2×SYBR Green PCR master mix、1?μL引物（10?μmol/L）、2?μL稀釋30倍的cDNA模板，并加入ddH2O至20?μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5?℃ 1?min，95?℃ 15?s，58?℃ 15?s，72?℃ 30?s，40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量=目的基因（SgPHRs）表達(dá)量/內(nèi)參基因（SgEF1a）表達(dá)量。定量PCR引物見表1。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)通過(guò)Microsoft Excel 2010軟件進(jìn)行平均數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)誤計(jì)算和作圖，采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件（V23.0，SPSS Institute，美國(guó)）進(jìn)行方差分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同磷濃度處理對(duì)柱花草干重和磷含量的影響

從圖1A可以看出，相對(duì)正常磷（250 μmol/L KH2PO4，CK）處理，低磷（0.5 μmol/L KH2PO4，LP）處理顯著抑制了柱花草地上部干重，但對(duì)根部干重沒有顯著影響。低磷處理下的地上部干重僅為正常磷條件下的46%（圖1A）。相對(duì)正常磷（CK）處理，低磷（LP）處理顯著降低了柱花草地上部和根部磷含量，低磷處理下的地上部和根部磷含量分別僅為正常磷條件下的17%和15%（圖1B）。

2.2 ?柱花草SgPHR1和SgPHR2的克隆

研究基于前期柱花草轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果獲得的SgPHR1和SgPHR2基因序列，設(shè)計(jì)PCR引物，以低磷處理下柱花草根系cDNA為模板，擴(kuò)增出SgPHR1和SgPHR2基因cDNA全長(zhǎng)。如圖2所示，SgPHR1和SgPHR2基因全長(zhǎng)分別為1413?bp和849?bp。利用ExPASyProt軟件分析發(fā)現(xiàn)SgPHR1基因編碼470個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為51.4?kD，理論等電點(diǎn)為5.4，為親水性蛋白。SgPHR2基因編碼282個(gè)氨基酸殘基，蛋白分子量為30.9?kD，理論等電點(diǎn)為7.7，也為親水性蛋白。

2.3 ?柱花草SgPHR1和SgPHR2蛋白理化性質(zhì)分析

利用WoLF PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果表明SgPHR1和SgPHR2蛋白均定位于細(xì)胞核上，暗示其為核蛋白。利用KinasePhos網(wǎng)站對(duì)SgPHR1和SgPHR2蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)SgPHR1蛋白具有14個(gè)絲氨酸、4個(gè)蘇氨酸和4個(gè)酪氨酸等潛在的磷酸化位點(diǎn)，而SgPHR2蛋白具有11個(gè)絲氨酸、6個(gè)蘇氨酸和1個(gè)酪氨酸等潛在的磷酸化位點(diǎn)（表2）。此外，SgPHR1蛋白的磷酸化位點(diǎn)主要分布在N端，而SgPHR2蛋白的磷酸化位點(diǎn)主要分布在C端（圖3）。

2.4 ?柱花草SgPHR1和SgPHR2蛋白保守結(jié)構(gòu)域和多序列比對(duì)分析

CDD Tools預(yù)測(cè)表明，SgPHR1和SgPHR2都屬于SANT家族成員，均含有PHR蛋白的保守序列，即myb_SHAQKYF和Myb_CC_LHEQLE特征序列（圖4）。SgPHR1蛋白在248～300和331～378氨基酸范圍內(nèi)，分別包含myb_SHAQKYF結(jié)構(gòu)域和Myb_CC_LHEQLE結(jié)構(gòu)域;SgPHR2蛋白在20～76和106～152氨基酸范圍內(nèi)，分別包含myb_ SHAQKYF結(jié)構(gòu)域和Myb_CC_LHEQLE結(jié)構(gòu)域。

多序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，SgPHR1和SgPHR2蛋白與已報(bào)道的不同物種PHR蛋白均包含myb_SHAQKYF和Myb_CC_LHEQLE保守結(jié)構(gòu)域。此外，不同物種PHRs蛋白N端和C端同源性較低（圖5）。

2.5 ?系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，PHRs蛋白可以分為3大組（圖6）。第Ⅰ組包括擬南芥、截形苜蓿（Medicago truncatula）、草莓（Fragaria vesca）和甘藍(lán)型油菜（Brassica naus）等植物PHR蛋白，如擬南芥AtPHR1和甘藍(lán)型油菜BnPHR1。柱花草SgPHR1被分在第Ⅰ組中，與截形苜蓿MtPHR1屬于同一分枝，同源性最高。第II組包括水稻、玉米和小麥（Triticum aestivum）等植物PHR蛋白，如水稻OsPHR1、OsPHR2、小麥TaPHR1和玉米ZmPHR1。第III組包括水稻、大豆、菜豆和柱花草等植物PHR蛋白。柱花草SgPHR2與菜豆PvPHR1、大豆GmPHR1和GmPHR25同源性最高（圖6）。

蛋白序列編號(hào)包括：柱花草SgPHR1、擬南芥（AtPHR1，NP_194590）、玉米（ZmPHR1，JF831533.1）、水稻（OsPHR1，AK063486.1）、草莓（FvPHR1，XP_004289982.1）、甘藍(lán)型（BnPHR1，JN806156.1）和大豆（GmPHR1，HQ007311）;紅色方框內(nèi)為MYB結(jié)構(gòu)域，藍(lán)色方框內(nèi)為CC結(jié)構(gòu)域。

2.6 ?柱花草SgPHR1和SgPHR2基因表達(dá)分析

本研究對(duì)SgPHR1和SgPHR2基因表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，SgPHR1和SgPHR2基因在根、莖和葉中均有表達(dá)，其中，SgPHR1在葉中表達(dá)量最高，根次之，莖中表達(dá)量最低，SgPHR2基因在葉中表達(dá)量顯著高于莖和根（圖7）。由于PHR基因被報(bào)道參與了植物對(duì)養(yǎng)分脅迫的應(yīng)答，本研究進(jìn)一步分析了不同缺素處理對(duì)柱花草SgPHR1和SgPHR2基因表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照（CK）相比，缺氮（–N）、缺磷（–P）和缺鉀（–K）處理均顯著增強(qiáng)了SgPHR1基因在柱花草根系中的表達(dá)（圖8A）;與對(duì)照相比，缺氮和缺磷處理顯著增強(qiáng)了SgPHR2基因在柱花草根系中的表達(dá)，而缺鉀處理對(duì)SgPHR2基因的表達(dá)無(wú)顯著影響（圖8A）。其中，缺磷處理下SgPHR1和SgPHR2基因表達(dá)量分別是對(duì)照條件下的1.3和2.6倍（圖8A）。

從圖8B可見，隨著低磷處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SgPHR1和SgPHR2基因表達(dá)量逐漸增加，并在低磷處理第7天基因表達(dá)量最高，SgPHR1和SgPHR2Genebank序列號(hào)包括：擬南芥（AtPHR1，NP_194590）、玉米（ZmPHR1，JF831533.1）、大豆（sGmPHR25，NP_001350613.1）、菜豆（PvPHR1，ACD13206.1）、水稻（OsPHR1，AK063486.1;OsPHR2，AK100065.1;OsPHR3，A2X0Q0.1;OsPHR4，XP_015644151.1）、小麥（TaPHR1，AGH13375.1）、草莓（FvPHR1，XP_004289982.1）、甘藍(lán)型油菜（BnPHR1，JN806156.1）、梅花（PmPHR1，XP_016650539.1）、桃李（PpPHR1，XP_020425868.1）、甜櫻桃（PaPHR1，XP_021831311.1）、海棠（MdPHR1，XP_008372382.1）、梨（PbPHR1，XP_018506029.1）、截形苜蓿（MtPHR1，XP_003625354.1）、可可樹（HcPHR1，XP_007050189.2）、巴西橡膠樹（HbPHR1，XP_021670552.1）、葡萄（VvPHR1，XP_002270511.1）、蘿卜（RsPHR1，XP_018469653.1）和大豆（GmPHR1，HQ007311）等。代表柱花草PHRs蛋白。

3 ?討論

磷是維持植物正常生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素之一，低磷脅迫抑制作物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。在水稻、大豆和玉米等植物中的研究發(fā)現(xiàn)，低磷脅迫顯著抑制了這些植物的植株生物量和磷含量[20-22]。類似的，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低磷處理顯著抑制了柱花草地上部干重，并降低了柱花草地上部和根部磷含量（圖1）。在應(yīng)對(duì)低磷脅迫過(guò)程中，植物形成了如改變根系形態(tài)構(gòu)建型等適應(yīng)性機(jī)制，進(jìn)而增強(qiáng)對(duì)土壤磷的吸收和利用[8]。低磷脅迫下植物的適應(yīng)性變化受到磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的精細(xì)調(diào)控，其中，轉(zhuǎn)錄因子PHR基因在植物磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[15]。因此，為探索柱花草響應(yīng)低磷脅迫的磷信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，本研究克隆了柱花草MYB-CC型轉(zhuǎn)錄因子SgPHR1和SgPHR2（圖2）。

近年來(lái)，對(duì)MYB型轉(zhuǎn)錄因子PHR功能研究較為廣泛，PHR在磷信號(hào)網(wǎng)路中起重要作用[14]。

據(jù)報(bào)道，擬南芥包括14個(gè)AtPHRs、大豆包括35個(gè)GmPHRs、水稻包括4個(gè)OsPHRs[19，22，28]。PHR轉(zhuǎn)錄因子具有高度保守的與DNA結(jié)合的MYB結(jié)構(gòu)域（myb_SHAQKYF）和與二聚體形成相關(guān)的螺旋CC結(jié)構(gòu)域（Myb_CC_LHEQLE）。PHR通過(guò)與下游磷饑餓誘導(dǎo)基因的啟動(dòng)子結(jié)合以調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的磷平衡。研究表明，MYB結(jié)構(gòu)域和卷曲螺旋CC結(jié)構(gòu)域都是PHR結(jié)合下游靶基因所必需的結(jié)構(gòu)域[29]。柱花草SgPHR1和SgPHR2均屬于SANT蛋白家族成員，包含myb_SHAQKYF和Myb_ CC_LHEQLE特征序列（圖4），表明柱花草SgPHR1和SgPHR2具備典型的PHR蛋白特性和結(jié)構(gòu)特征。

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，柱花草SgPHR1被分在第Ⅰ組中（圖6），這一組包括擬南芥AtPHR1、油菜BnPHR1和草莓FvPHR1等蛋白，這些蛋白被認(rèn)為是植物響應(yīng)低磷脅迫的重要因子[28，30]。如，AtPHR1定位在細(xì)胞核內(nèi)，是擬南芥關(guān)鍵的磷信號(hào)調(diào)控因子[18]。BnPHR1是甘藍(lán)型油菜響應(yīng)低磷的重要調(diào)控因子，具有調(diào)控下游磷饑餓響應(yīng)基因表達(dá)，從而促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收和維持磷平衡的生物學(xué)功能[31]。草莓FvPHR1定位于細(xì)胞核內(nèi)，F(xiàn)vPHR1被報(bào)道可以直接激活下游磷饑餓響應(yīng)基因的表達(dá)[30]。柱花草SgPHR2與大豆GmPHR1和GmPHR25以及菜豆PvPHR1等被分在第III組中。大豆GmPHR25定位在細(xì)胞核中，具有調(diào)控大豆磷穩(wěn)態(tài)的生物學(xué)功能[22]。PvPHR1被報(bào)道是調(diào)控菜豆磷轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的正調(diào)節(jié)因子[23]。因此，SgPHR1和SgPHR2可能具有植物PHR蛋白保守的生物學(xué)功能。

氮、磷和鉀是植物正常生長(zhǎng)和發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素。研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因的表達(dá)受到氮、磷和鉀等元素缺乏的影響[14，32，33]。如，在水稻中，缺磷處理能夠增強(qiáng)水稻根中MYB家族基因OsPHR4的表達(dá)[31]。在大豆中，缺氮處理增強(qiáng)了7個(gè)GmPHR家族基因在根中的表達(dá)[22]。另外，轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，缺鉀處理也能調(diào)控水稻和番茄（Lycopersicon esculentum）多個(gè)MYB家族基因的表達(dá)[34-35]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，缺磷和缺氮處理均顯著增強(qiáng)了SgPHR1和SgPHR2在柱花草根系中的表達(dá)，表明SgPHR1和SgPHR2可能受到氮磷協(xié)同調(diào)控，進(jìn)而參與了柱花草對(duì)氮和磷脅迫的應(yīng)答。另外，SgPHR1和SgPHR2表達(dá)量隨著磷饑餓處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加（圖8）。類似的，缺磷處理增加了OsPHR3和OsPHR4在水稻根部中的表達(dá)量[31]，而玉米ZmPHR1在根和葉中的表達(dá)也會(huì)隨著磷饑餓程度增加而增加[21]。然而，研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtPHR1、水稻OsPHR1和OsPHR2等PHR基因在轉(zhuǎn)錄水平上不受外源磷的影響，這些PHRs基因可能通過(guò)翻譯后水平調(diào)控植物響應(yīng)低磷脅迫[19，32]。雖然低磷處理對(duì)擬南芥AtPHR1基因表達(dá)的影響不明顯，但是，與野生型擬南芥相比，phr1突變體缺失對(duì)磷饑餓響應(yīng)基因的調(diào)控，表明AtPHR1在擬南芥磷信號(hào)網(wǎng)路中起重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用[18-19]。因此，SgPHR1和SgPHR2可能作為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子參與了柱花草對(duì)低磷脅迫的響應(yīng)。

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