植物激素脫落酸分子的光譜與結(jié)構(gòu)研究： 理論與實(shí)驗(yàn)

張燕燕， 李冬賢， 馬劉正， 張 浩， 蘇 睿， 李林澤， 胡建東,3*

1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院， 河南 鄭州 450002 2. 河南省農(nóng)業(yè)激光技術(shù)國(guó)際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450002 3. 小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450002

引 言

植物激素是由植物在自身體內(nèi)合成的一類(lèi)微量有機(jī)物質(zhì)[1]， 在植物體內(nèi)某一部位產(chǎn)生， 再轉(zhuǎn)運(yùn)到作用部位[2]， 在含量極低的情況下就能對(duì)植物的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的生理效應(yīng)[3]。 脫落酸(abscisic acid， ABA)是天然的生長(zhǎng)抑制素， 因能促進(jìn)植物的葉子脫落而得名[4]， 具有調(diào)節(jié)植物氣孔關(guān)閉、 抑制種子萌發(fā)、 促進(jìn)植物休眠等作用， 在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中有極大的應(yīng)用前景， 因此植物中ABA的痕量檢測(cè)對(duì)于構(gòu)建植物激素測(cè)定的新思想新方法有著重要的意義[5]。 目前， 已經(jīng)報(bào)道了多種ABA定量檢測(cè)的技術(shù)， 包括氣相色譜/質(zhì)譜(GC/MS)[6]、 高效液相色譜/質(zhì)譜(HPLC/MS)[7]、 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)[8]、 毛細(xì)管電泳[9]、 化學(xué)發(fā)光法[10]及局域表面等離子共振法(LSPR)[11]等。 這些方法由于其敏感性和選擇性較高可以檢測(cè)植物激素到超低水平， 但是它們通常耗時(shí)， 需要繁瑣的樣品預(yù)處理和富集。 因此， 在農(nóng)業(yè)工程的研究上非常需求發(fā)展一個(gè)敏感， 快速， 簡(jiǎn)單的植物激素測(cè)定方法， 而拉曼光譜技術(shù)因其靈敏度高、 樣品前處理快速簡(jiǎn)單而廣泛應(yīng)用于有機(jī)、 無(wú)機(jī)和小分子檢測(cè)中， 而利用拉曼光譜技術(shù)定量檢測(cè)ABA的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

密度泛函理論(density functional theory， DFT)是通過(guò)電子密度來(lái)研究多種領(lǐng)域中電子結(jié)構(gòu)的領(lǐng)先方法[12]， 利用DFT計(jì)算待測(cè)分子的分子軌道、 靜電勢(shì)、 電子躍遷能級(jí)可以為實(shí)驗(yàn)研究提供分子層面的解析。 近年來(lái)， 利用DFT理論對(duì)分子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行優(yōu)化研究分子光譜性能的報(bào)道越來(lái)越多， 逯美紅等利用DFT對(duì)莧菜紅分子結(jié)構(gòu)和SERS進(jìn)行研究， 得到莧菜紅分子理論拉曼光譜的特征峰[13]； 何偉平等對(duì)頭孢氨芐的密度泛函進(jìn)行研究， 進(jìn)一步驗(yàn)證頭孢氨芐的分子結(jié)構(gòu)[14]； Dikmen利用DFT對(duì)3，5二甲氧基4羥基肉桂酸的Raman， SERS進(jìn)行研究， 研究銀原子與分子結(jié)構(gòu)的最佳結(jié)合位點(diǎn)， 為3，5二甲氧基4羥基肉桂酸的表面增強(qiáng)拉曼研究奠定理論基礎(chǔ)[15]。 目前， 利用DFT理論對(duì)植物激素ABA的光譜研究還未見(jiàn)到報(bào)道。

從理論和實(shí)驗(yàn)兩個(gè)方面對(duì)ABA分子的光譜和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究， 運(yùn)用Gaussian09的B3LYP/6-31G(d，p)基組研究了ABA分子的Raman， SERS和IR； 運(yùn)用Gaussian的NMR方法計(jì)算ABA的NMR譜； 將所得的理論計(jì)算光譜與實(shí)驗(yàn)所得的譜學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比， 對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析， 以保證計(jì)算得到的每一個(gè)穩(wěn)定構(gòu)型都對(duì)應(yīng)勢(shì)能面上的一個(gè)局域最小點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 方法

實(shí)驗(yàn)中所用的ABA樣品購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司， 粉末狀， 分子式為C15H20O4， 分子量為264.32 g·mol-1。 取0.5 mg的ABA粉末放于硅片上， 由顯微共聚焦拉曼光譜儀(中國(guó)卓立漢光)測(cè)得ABA的拉曼光譜； 在120 ℃的條件下， 采用0.5 mL、 1%檸檬酸三鈉溶液還原50 mL、 0.01%的氯金酸溶液制得微粒尺寸60 nm的金溶膠， 金溶膠的SPR峰在530 cm-1。 各取10 μL 1 mmol·L-1的ABA溶液與60 nm的金溶膠混合， 取混合物10 μL滴在干凈的硅片上， 室溫晾干， 檢測(cè)其SERS光譜； ABA的紅外光譜由Nexus470智能型傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)NICOLET)測(cè)量； 核磁共振光譜由400MR核磁共振波譜儀(美國(guó)安捷倫)測(cè)量。

1.2 計(jì)算方法

采用Gaussian09和GaussVeiw5.0軟件， 在DFT的 B3LYP/6-31G(d，p)基組水平上搭建分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化并進(jìn)行計(jì)算， 計(jì)算ABA的Raman和IR， 利用NMR的B3LYP/6-31+G(d)基組來(lái)計(jì)算NMR， 并將理論計(jì)算得到的Raman， IR， NMR與實(shí)驗(yàn)所得的相應(yīng)光譜進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與討論

2.1 脫落酸分子結(jié)構(gòu)優(yōu)化

ABA分子由有39個(gè)原子和146個(gè)電子組成， 基于DFT， 使用Gaussian 09將ABA分子優(yōu)化至最低能級(jí)， 結(jié)構(gòu)優(yōu)化計(jì)算后， 分子構(gòu)型的5個(gè)最小振動(dòng)頻率值為： 24.83， 36.56， 39.19， 71.16和89.88， 它們對(duì)應(yīng)的振動(dòng)強(qiáng)度分別為1.538 4， 2.804 3， 2.534 0， 0.076 3和0.726 2， 說(shuō)明優(yōu)化后的分子無(wú)虛態(tài)， 分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定， 可以作為后續(xù)光譜分析的結(jié)構(gòu)。 優(yōu)化后的總能量為-884.54 eV， 偶極矩為1.435 3。 其優(yōu)化后的分子結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 脫落酸的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structure of ABA

由圖1可以看出， ABA的分子結(jié)構(gòu)主要由C2， C3， C4， C6， C7和C8組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)和五個(gè)甲基C1-H20-H21-H22， C16-H30-H31-H32， C18-H34-H35-H36， C19-H37-H38-H39， C26-H40-H41-H42， 一個(gè)羰基C4-O5， 一個(gè)羧基C13-O14-O15-H29、 一個(gè)羥基O17-H33組成。

2.2 能級(jí)和分子軌道

Gaussian09計(jì)算了ABA分子能量最高的6個(gè)占據(jù)軌道和能量最低的6個(gè)空軌道能級(jí)， 為了更全面地觀察軌道電勢(shì)分布情況， 選擇對(duì)電子虛態(tài)的其中6個(gè)空軌道76—81軌道和電子占據(jù)的其中6個(gè)軌道70—75軌道計(jì)算電勢(shì)。 如圖2所示： 第75號(hào)分子軌道為HOME軌道，E75=-0.244 88 eV； 第76號(hào)分子軌道為L(zhǎng)UME軌道，E76=-0.094 39 eV， 能隙ΔE=E76-E75=-0.150 49 eV， 能隙很小， 表明電子容易從HOME軌道躍遷到LUME軌道。

圖2 脫落酸的分子軌道能級(jí)圖Fig.2 Molecular orbital energy level diagram of ABA

圖3 脫落酸的分子軌道電子云分布圖Fig.3 Distribution of molecular orbital electron clouds of ABA

2.3 拉曼和表面增強(qiáng)拉曼光譜

如圖4所示， ABA的拉曼特征峰主要集中在600～1 700 cm-1之間， 這個(gè)區(qū)間內(nèi)分子微運(yùn)動(dòng)方式主要是伸縮振動(dòng)和搖擺振動(dòng)， 在1 800～2 900 cm-1之間沒(méi)有特征峰。 計(jì)算的拉曼最強(qiáng)峰在1 689 cm-1， 實(shí)驗(yàn)拉曼的最強(qiáng)峰在1 635 cm-1， 實(shí)驗(yàn)SERS的最強(qiáng)峰在1 625 cm-1， 計(jì)算值較實(shí)驗(yàn)測(cè)定的拉曼數(shù)值和SERS測(cè)定的數(shù)值大， 這是由于在高斯的計(jì)算模擬中將分子看做是單獨(dú)的， 不考慮分子之間相互作用的影響。 若高斯計(jì)算時(shí)取修正系數(shù)為0.97， 那么DFT計(jì)算所得的最強(qiáng)峰頻移為1 638 cm-1， 與實(shí)驗(yàn)測(cè)的拉曼頻移1 635 cm-1相差3 cm-1， 差別較小， 說(shuō)明計(jì)算的拉曼頻移與實(shí)驗(yàn)測(cè)定的拉曼頻移吻合良好。

圖4 脫落酸的DFT計(jì)算、 拉曼實(shí)驗(yàn)和SERS實(shí)驗(yàn)對(duì)比Fig.4 The comparison of DFT calculation, Ramanand SERS experiment of ABA

對(duì)比DFT計(jì)算、 Raman和SERS實(shí)驗(yàn)， ABA分子信號(hào)較強(qiáng)的拉曼峰有五個(gè)， 分別是1 635， 1 271， 1 048， 865和612 cm-1， 分別對(duì)應(yīng)于ABA分子結(jié)構(gòu)中碳碳雙鍵的伸縮振動(dòng)、 碳碳單鍵的伸縮振動(dòng)、 甲基的非平面擺動(dòng)、 碳碳單鍵的外扭式振動(dòng)及碳?xì)滏I的平面和非平面擺動(dòng)， 說(shuō)明ABA的拉曼特征峰主要來(lái)自于碳碳雙鍵和碳碳單鍵的振動(dòng)， 其中碳碳雙鍵的伸縮振動(dòng)引起的拉曼散射最強(qiáng)， 所以1 635 cm-1可以作為ABA的拉曼特征峰用于植物激素ABA的定性和定量檢測(cè)。

不同的拉曼頻移對(duì)應(yīng)于分子中不同原子和基團(tuán)的振動(dòng)， ABA的拉曼頻移對(duì)應(yīng)的振動(dòng)模式如表1所示： 拉曼頻移小于1 100 cm-1所對(duì)應(yīng)的分子振動(dòng)模式以C—H鍵的非平面遙擺振動(dòng)為主； 拉曼頻移在1 100～1 600 cm-1之間所對(duì)應(yīng)的分子振動(dòng)模式以C—C單鍵的非對(duì)稱伸縮為主； 拉曼頻移在1 600～1 800 cm-1之間所對(duì)應(yīng)的分子振動(dòng)模式以碳碳雙鍵的對(duì)稱伸縮為主； 拉曼頻移大于2 900 cm-1時(shí)所對(duì)應(yīng)的分子振動(dòng)模式以C—O和C—H單鍵的非對(duì)稱伸縮和非平面振動(dòng)為主； 如： 拉曼頻移在1 053 cm-1所對(duì)應(yīng)分子振動(dòng)為： 五個(gè)甲基的非平面振動(dòng)， 以及C6-H25， C6-H24， C9-H26， C12-H28和C3-H23的平面振動(dòng)， 除了O原子以外， 幾乎所有的C—H都振動(dòng)； 1 056 cm-1對(duì)應(yīng)C10-C27的非平面振動(dòng)， 四個(gè)甲基C16-H30-H31-H32， C1-H20-H21-H22， C19-H37-H381-H39， C18-H35-H36-H34的非平面振動(dòng)， 但甲基C16-H30-H31-H32的振動(dòng)最為劇烈； 1075對(duì)應(yīng)甲基C16-H30-H31-H32的劇烈非平面振動(dòng)， 其他四個(gè)甲基不動(dòng)； 1 688 cm-1對(duì)應(yīng)于C9-C10對(duì)稱伸縮振動(dòng)和C11-C12的非對(duì)稱伸縮。 高斯計(jì)算后顯示： 凡是拉曼峰較強(qiáng)的位置都反映在分子結(jié)構(gòu)的整體振動(dòng)上， 幾乎沒(méi)有原子或基團(tuán)是靜止不動(dòng)的， 所以拉曼峰較強(qiáng)的位置都是幾個(gè)分子或基團(tuán)相應(yīng)振動(dòng)疊加的結(jié)果。

表1 脫落酸的DFT， Raman， SERS特征峰及其歸屬Table 1 DFT， Raman and SERS characteristic peaks of ABA and their attribution

2.4 紅外光譜

紅外光譜反映的是分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)的加和表現(xiàn)， 不同分子的振動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng)不同， 紅外光譜具有高度的特異性， 與拉曼光譜相互補(bǔ)充， 用于表征和鑒別各種化學(xué)物種。 圖5(a,b)分別為實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的ABA紅外光譜與計(jì)算得到的紅外光譜圖， 對(duì)比發(fā)現(xiàn)： 紅外光譜的實(shí)測(cè)結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合良好， 計(jì)算得到的紅外光譜可作為拉曼定量檢測(cè)的補(bǔ)充。

圖5 紅外吸收光譜(IR)(a): 實(shí)驗(yàn)； (b): 計(jì)算Fig.5 Infrared absorption spectra of ABA(IR)(a): Experiment-IR spectrum; (b): DFT-IR spectrum

2.5 核磁共振譜

ABA分子結(jié)構(gòu)中含有羥基和羧基， 在核磁共振檢測(cè)時(shí)羥基和羧基中的氫易發(fā)生不顯示的情況， 為了保證全部氫原子的相對(duì)位移都能確定， 檢測(cè)時(shí)， 各取兩份10 mg的ABA粉末分別溶于0.5 mL的甲醇和DMSO溶劑， 對(duì)比確定H原子的相對(duì)位移。 圖6為以DMSO為溶劑ABA的1H核磁共振譜， 對(duì)比甲醇溶劑的1H譜和DMSO中的1H譜發(fā)現(xiàn)， 甲醇溶劑的1H譜有19個(gè)H， 而DMSO溶劑的1H譜有20個(gè)H， DMSO溶劑的1H譜比甲醇溶劑的1H譜多了羥基上的氫。 其他位置氫相對(duì)位移的實(shí)驗(yàn)與計(jì)算值如表2所示， 實(shí)驗(yàn)與計(jì)算值最大相差1.052 ppm。

表2 脫落酸的1H-NMR相對(duì)位移Table 2 1H-NMR relative displacement of ABA

圖6 脫落酸的1H-NMRFig.6 1H-NMR of the ABA

圖7為ABA的13C核磁共振譜， 分子結(jié)構(gòu)中不同位置C原子相對(duì)位移的實(shí)驗(yàn)值與計(jì)算值如表3所示， 實(shí)驗(yàn)與計(jì)算值最大相差13.785 ppm。 實(shí)驗(yàn)與計(jì)算結(jié)果對(duì)比說(shuō)明： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與DFT計(jì)算結(jié)果較一致， 利用DFT計(jì)算ABA的核磁共振譜可以作為對(duì)ABA分子結(jié)構(gòu)研究的補(bǔ)充和依據(jù)。

圖7 脫落酸的13C-NMRFig.7 13C-NMR of the ABA

表3 脫落酸的13C-NMR相對(duì)位移Table 3 13C-NMR relative displacement of ABA

3 結(jié) 論

基于密度泛函理論， 對(duì)ABA分子搭建分子結(jié)構(gòu)并進(jìn)行優(yōu)化， 得到其穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。 利用Gaussian09的B3LYP/6-31G(d， p)基組和NMR方法， 計(jì)算ABA分子的常規(guī)Raman光譜、 IR及NMR譜。 在此基礎(chǔ)上， 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ABA的Raman、 SERS、 IR及NMR譜， 最后將計(jì)算譜圖與實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比及振動(dòng)譜指認(rèn)歸屬。 結(jié)果說(shuō)明： 理論計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果吻合良好， ABA分子拉曼峰較強(qiáng)的位置都反映在分子結(jié)構(gòu)的整體運(yùn)動(dòng)上， 幾乎沒(méi)有原子或基團(tuán)是靜止不動(dòng)的， 拉曼峰較強(qiáng)的位置都是幾個(gè)原子或基團(tuán)相應(yīng)振動(dòng)疊加的結(jié)果， 信號(hào)最強(qiáng)的特征峰在1 635 cm-1， 主要來(lái)自于碳碳雙鍵的劇烈伸縮振動(dòng)和碳碳單鍵的伸縮振動(dòng)， 1 635 cm-1可以作為拉曼特征峰用于ABA的定性和定量檢測(cè)。 這些工作將為光譜技術(shù)在植物激素檢測(cè)中的發(fā)展和應(yīng)用提供一定的實(shí)驗(yàn)參考和理論支撐， 對(duì)后期植物激素ABA的定量檢測(cè)研究提供可靠的理論基礎(chǔ)。