秸稈-牛糞發(fā)酵過(guò)程中溶解性有機(jī)質(zhì)的熒光光譜特征

李 艷， 魏 丹*， 王 偉， 金 梁， 丁建莉， 蔡姍姍， 胡 鈺， 白 楊

1. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150030 2. 北京市農(nóng)林科學(xué)院植物營(yíng)養(yǎng)與資源研究所， 北京 100097 3. 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料與環(huán)境資源研究所， 黑龍江 哈爾濱 150086 4. 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院， 遼寧 沈陽(yáng) 110866

引 言

隨著我國(guó)農(nóng)作物年產(chǎn)量增加， 秸稈處理難、 利用率低已成為農(nóng)業(yè)綠色、 可持續(xù)發(fā)展的難點(diǎn)問(wèn)題[1]。 同時(shí)， 畜禽養(yǎng)殖量增加導(dǎo)致畜禽糞便量積累， 需要通過(guò)安全的手段將農(nóng)業(yè)、 畜牧業(yè)產(chǎn)生的有機(jī)廢棄物通過(guò)生物代謝作用進(jìn)行轉(zhuǎn)化， 形成的物質(zhì)富含大量的腐殖酸， 可為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的有機(jī)肥提供養(yǎng)分來(lái)源[2]。 以牛糞、 秸稈為發(fā)酵原料， 經(jīng)過(guò)堆腐形成有機(jī)肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中被廣泛使用[3]。

溶解性有機(jī)物(dissolved organic matter,DOM)是生態(tài)系統(tǒng)中能量輸入的活躍成分和物質(zhì)循環(huán)的重要組成部分[4]， 因其具有高度流動(dòng)性、 不穩(wěn)定性， 可以對(duì)物質(zhì)遷移和轉(zhuǎn)化產(chǎn)生影響[5-7]。 目前， 國(guó)內(nèi)外對(duì)于DOM的研究主要集中于其來(lái)源、 分布、 組成特征、 遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律和生物毒性等方面， 研究所采用技術(shù)主要為紫外-可見(jiàn)光譜、 三維熒光光譜、 核磁共振和傅里葉變換紅外光譜等， 并借助多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)DOM進(jìn)行定量或定性分析[5-8]。

研究有機(jī)物料發(fā)酵過(guò)程中DOM組分結(jié)構(gòu)對(duì)了解發(fā)酵及腐熟度具有十分重要的意義， 如Xie等[2]利用三維熒光光譜技術(shù)結(jié)合二維相關(guān)光譜和結(jié)構(gòu)方程解析方法， 以綜合分析畜禽糞便和秸稈堆肥過(guò)程中胡敏素合成和演化機(jī)制及影響因素。 Gao等[9]利用三維熒光光譜技術(shù)和傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對(duì)堆肥腐殖化過(guò)程研究結(jié)果表明， 與秸稈相比， 糞污穩(wěn)定性和腐殖化程度較低， 腐殖化過(guò)程具有多個(gè)相同的熒光結(jié)構(gòu)， 而秸稈腐殖化程度主要受含碳物質(zhì)的影響。 張豐松等[10]利用三維熒光光譜技術(shù)測(cè)定豬糞、 牛糞發(fā)酵后的DOM熒光特性結(jié)果得出， 畜禽糞便堆肥發(fā)酵后DOM組成發(fā)生變化， 含有大量的富里酸和胡敏酸， 并與畜禽糞便中的重金屬Cu發(fā)生絡(luò)合作用， 使絡(luò)合物的遷移性和生物可利用性降低。

基于此， 本研究選擇玉米秸稈和牛糞進(jìn)行有氧發(fā)酵， 按照不同體積比例進(jìn)行處理， 通過(guò)三維熒光光譜技術(shù)結(jié)合平行因子分析法對(duì)發(fā)酵過(guò)程中樣品DOM熒光特性進(jìn)行分析， 分析發(fā)酵時(shí)間及不同比例對(duì)DOM組成和結(jié)構(gòu)的影響； 為進(jìn)一步探討玉米秸稈-牛糞發(fā)酵過(guò)程中DOM的遷移轉(zhuǎn)化和變化規(guī)律提供科學(xué)依據(jù)； 對(duì)生產(chǎn)實(shí)踐中提高堆肥腐熟度和堆肥品質(zhì)， 選擇最優(yōu)物料比例和提高秸稈利用率具有十分重要的理論與實(shí)際意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

玉米秸稈采自黑龍江省哈爾濱市道外區(qū)民主鄉(xiāng)光明村， 將田間玉米收獲后所得的秸稈風(fēng)干， 粉碎至平均長(zhǎng)度約為3 cm； 牛糞采自哈爾濱市民主鄉(xiāng)光明村農(nóng)戶家， 為圈養(yǎng)牛的新鮮糞便。 玉米秸稈和牛糞基本理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 玉米秸稈和牛糞的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physiochenmical properties of corn straw and cow dung

1.2 方法

實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)置在黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院晾曬場(chǎng)， 通風(fēng)條件良好。 發(fā)酵過(guò)程在塑料材質(zhì)的小型發(fā)酵保溫箱(80 L)中進(jìn)行， 發(fā)酵箱密閉條件良好(發(fā)酵箱內(nèi)安裝有溫度計(jì)， 檢測(cè)發(fā)酵過(guò)程中溫度控制)。 實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理， 按照玉米秸稈∶牛糞， 體積比分別為2∶8(T1)、 4∶6(T2)、 6∶4(T3)和8∶2(T4)， 每個(gè)處理重復(fù)3次。 堆肥發(fā)酵前先將粉碎的玉米秸稈與牛糞按體積比混合均勻， 用尿素將C/N比調(diào)整為25∶1。 發(fā)酵實(shí)驗(yàn)期間， 每隔4 d進(jìn)行翻堆(用鐵鍬進(jìn)行上下攪拌)， 并調(diào)節(jié)發(fā)酵物料含水量， 使其水分含量維持在55%～60%。 所有處理同時(shí)進(jìn)行， 自2019年5月7日至2019年6月17日， 共計(jì)40 d。 分別采集第5， 10， 15， 20， 25， 30， 35和40 d的樣品， 共采集8次。 采樣時(shí)每個(gè)處理從保溫箱體(上部、 中部、 下部)各取60 g， 取樣3次重復(fù)后混合均勻。 去除雜質(zhì)后將樣品自然風(fēng)干， 粉碎過(guò)篩(孔徑2 mm)， 在常溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

參考文獻(xiàn)[11]的方法， 本研究取風(fēng)干粉碎后樣品5 g， 加入雙蒸水(Milli-Q,電阻率為18.2 MΩ·cm-1)， 質(zhì)量體積比[W(g)∶V(mL)]為1∶10， 室溫條件下水平振蕩(200 r·min-1) 24 h。 用離心機(jī)離心20 min (4 ℃,12 000 r·min-1)， 上清液過(guò)孔徑為0.45 μm的濾膜， 濾液即為DOM。 利用multi N/C 2100型TOC分析儀(Analytik Jena AG,德國(guó))測(cè)定樣品溶液DOM濃度， 稀釋溶液DOM濃度調(diào)至15 mg·L-1。

利用熒光光譜測(cè)定儀(日立F-7000型,日本)測(cè)定溶液DOM熒光特性， 參數(shù)設(shè)置同樣參考文獻(xiàn)[11]的方法： PMT電壓： 700 V； 激發(fā)光源： 450 W氙弧燈； 信噪比>110； 帶通： Ex和Em均為5 nm； 掃描速度： 1 200 nm·min-1； 響應(yīng)時(shí)間： 儀器自動(dòng)校正； 三維熒光光譜掃描范圍： Ex和Em均設(shè)置為200～600 nm。 在熒光發(fā)射光一側(cè)添加截止濾光片(290 nm)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用熒光光譜軟件[FL WinLab software (Perkin Elmer)]進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集， Matlab R2013a軟件Removescatter工具包進(jìn)行去散射處理， DOMFluor工具包進(jìn)行平行因子分析， 運(yùn)用殘差分析和對(duì)半分析進(jìn)行模型檢驗(yàn)， 繪制三維熒光圖譜。 參考文獻(xiàn)[6]， 通過(guò)Origin 2019b軟件， 計(jì)算熒光光譜指數(shù)： 熒光指數(shù)(fluorescence index,FI)、 生物指數(shù)(biological index,BIX)、 腐殖化指數(shù)(humification index,HIX)。 利用SPSS 19.0軟件進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 DOM熒光光譜指數(shù)

采用FI， BIX和HIX表征不同比例秸稈-牛糞發(fā)酵過(guò)程中DOM的來(lái)源特征和腐殖化程度， 見(jiàn)表2。 FI可反映腐殖質(zhì)來(lái)源， BIX衡量自生源有機(jī)質(zhì)在所測(cè)物質(zhì)中的相對(duì)百分比大小， HIX表征有機(jī)質(zhì)腐殖化程度[6]。 發(fā)酵至第40 d時(shí)， 4個(gè)處理FI介于1.722～1.936， 不同處理FI均大于1.4， 其中T1和T2小于1.9， 說(shuō)明這兩個(gè)處理中DOM來(lái)源受自生源和外生源共同作用的影響， 既來(lái)自于秸稈-牛糞物料中自身的DOM， 亦有發(fā)酵過(guò)程中微生物分解物料新近產(chǎn)生。 T3和T4的FI均大于1.9， T3條件下表現(xiàn)更強(qiáng)的自生源特性， DOM更多來(lái)自于微生物的分解作用。 BIX變化范圍為0.842～0.905， 說(shuō)明4個(gè)處理發(fā)酵至第40 d時(shí)， DOM均呈現(xiàn)較強(qiáng)的自生源特征(0.8

表2 DOM熒光光譜指數(shù)Table 2 Fluorescence spectrum indices of DOM

2.2 DOM熒光組分特征

采用平行因子法分析不同處理DOM的三維熒光光譜數(shù)據(jù)， 均得到3種熒光組分。 參考文獻(xiàn)[4,8,13-14]， 4個(gè)處理熒光組分和熒光峰類型結(jié)果見(jiàn)表3， 熒光組分的三維熒光光譜分布見(jiàn)圖1。

表3 不同處理的DOM熒光組分特征Table 3 Characteristics of DOM fluoresceocecomponents in different treatments

圖1 不同處理DOM三維熒光組分A峰： 紫外光區(qū)類富里酸； C峰： 可見(jiàn)光區(qū)類富里酸； T峰： 短波類色氨酸(類蛋白質(zhì))；T1峰： 長(zhǎng)波類色氨酸； F峰： 類胡敏酸； B峰： 類酪氨酸(類蛋白質(zhì))Fig.1 Three dimensional fluorescence components of DOM in different treatmentsPeak A: fulvic acid in UV region; Peak C: fulvic acid in visible region; Peak T: short wave tryptophan (proteinoid);Peak T1: long wave tryptophan; Peak F: humicacid; Peak B: tyrosine (proteinoid)

4個(gè)處理中DOM的3個(gè)熒光組分相同。 其中組分C1包含2個(gè)激發(fā)峰和1個(gè)發(fā)射峰， 分別代表紫外光區(qū)類富里酸和可見(jiàn)光區(qū)類富里酸， 分別對(duì)應(yīng)著A峰和C峰。 李帥東等[14]研究表明腐殖質(zhì)化學(xué)結(jié)構(gòu)中羧基和羥基與類富里酸含量有關(guān)。 A峰所代表的物質(zhì)主要由相對(duì)分子質(zhì)量較大、 生物可降解性較低的有機(jī)物產(chǎn)生， C峰所代表的物質(zhì)主要源于相對(duì)分子質(zhì)量較小的有機(jī)物， 這類物質(zhì)一般生物可降解性較高， 具有良好的光化學(xué)性， 表現(xiàn)出較高的熒光效率， 易被氧化分解。 這兩類物質(zhì)均屬于類腐殖酸， 常指示外源物質(zhì)的輸入。

組分C2包含2個(gè)激發(fā)峰和1個(gè)發(fā)射峰， 均指示類色氨酸， 與羧基官能團(tuán)有關(guān)， 分別對(duì)應(yīng)指示短波類色氨酸的T峰和指示長(zhǎng)波類色氨酸的T1峰。 張博等[15]研究表明在發(fā)酵過(guò)程中類色氨酸是微生物降解的溶解性代謝產(chǎn)物， 易與在同一蛋白質(zhì)中結(jié)合的酪氨酸發(fā)生能量轉(zhuǎn)移， 對(duì)熒光峰具有復(fù)雜影響， 類色氨酸屬于類蛋白質(zhì)組分。

組分C3包含2個(gè)激發(fā)峰和1個(gè)發(fā)射峰， 代表了類胡敏酸， 屬于腐殖質(zhì)類物質(zhì)， 對(duì)應(yīng)F峰。 類胡敏酸分子量較大， 腐殖化程度較高， Nie等[16]研究中類胡敏酸含有多環(huán)芳烴和苯環(huán)， 且與木質(zhì)素降解有關(guān)。

組分C4為類酪氨酸， 代表類蛋白質(zhì)， 對(duì)應(yīng)B峰。 Xu和Jiang[17]研究結(jié)果表明， 類酪氨酸與DOM中在微生物作用下降解的蛋白質(zhì)類物質(zhì)結(jié)構(gòu)相關(guān)， 因其分子量小所以比類色氨酸更容易被降解。 C2和C4同屬于類蛋白質(zhì)物質(zhì)。

綜上所述， 以秸稈-牛糞為原料發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的熒光組分為： 類富里酸(紫外類富里酸、 可見(jiàn)類富里酸)、 類胡敏酸和類蛋白質(zhì)(類色氨酸、 類酪氨酸)， 與Xu和Jiang[17]在有機(jī)物料發(fā)酵過(guò)程的熒光特性研究結(jié)果一致。

2.3 DOM熒光組分熒光強(qiáng)度

為分析發(fā)酵過(guò)程中DOM的熒光組分隨發(fā)酵時(shí)間變化規(guī)律， 對(duì)DOM不同組分的熒光強(qiáng)度和相對(duì)百分比進(jìn)行分析。 如圖2， 隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)， 不同處理類富里酸熒光強(qiáng)度呈增強(qiáng)趨勢(shì)， 熒光強(qiáng)度T1>T4>T3>T2； 類胡敏酸熒光強(qiáng)度呈增強(qiáng)趨勢(shì)， 熒光強(qiáng)度T3>T1>T2>T4； 類蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度呈減弱趨勢(shì)， 熒光強(qiáng)度T1>T2>T3>T4。 總熒光強(qiáng)度(C1+C2+C3+C4)隨發(fā)酵時(shí)間先增加后減少， 最后趨于穩(wěn)定。 最大總熒光強(qiáng)度出現(xiàn)在發(fā)酵第15 d， 此時(shí)T1>T3>T4>T2， 其中T1總熒光強(qiáng)度為(3 889.35±21.33) R.U.， T3總熒光強(qiáng)度為(3 733.59±57.30) R.U.。 Reader等[5]研究表明， 熒光強(qiáng)度的高低與發(fā)酵產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)相關(guān)， 類蛋白質(zhì)因含有相對(duì)分子質(zhì)量大的羧基、 羰基等電子基團(tuán)， 熒光強(qiáng)度較低； 類腐殖質(zhì)因含有氨基、 甲氧基、 羥基等電子基團(tuán)， 熒光強(qiáng)度較高。 因此， 隨著秸稈比例的升高， 秸稈-牛糞腐殖化程度隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加， 隨著發(fā)酵溫度的升高， 發(fā)酵第15 d物料轉(zhuǎn)化速率最快， 發(fā)酵物料中的脂肪、 糖類、 蛋白質(zhì)和碳水化合物等在微生物的作用下分解生成結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、 相對(duì)分子質(zhì)量小的線形芳香環(huán)腐殖質(zhì)類有機(jī)物， 熒光強(qiáng)度較高； 類色氨酸和類酪氨酸等類蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度較低， 其中T3中類胡敏酸熒光強(qiáng)度及相對(duì)百分比最大。 Gao等[9]研究結(jié)果表明， 熒光強(qiáng)度與DOM結(jié)構(gòu)密切相關(guān)， 各熒光峰熒光強(qiáng)度可以間接揭示DOM含有的活性官能團(tuán)及DOM性質(zhì)， 所以本研究中第15 d樣品可作為熒光物質(zhì)轉(zhuǎn)化的檢測(cè)點(diǎn)。

圖2 不同處理?xiàng)l件下的DOM各組分熒光強(qiáng)度和相對(duì)百分比Fig.2 Fluorescence intensity and relative percentage of DOM components in different treatments

3種熒光組分的相對(duì)百分比變化趨勢(shì)同熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)一致， 不同處理間類富里酸組分相對(duì)百分比T1>T4>T3>T2； 類胡敏酸的組分相對(duì)百分比T3>T1>T2>T4； 類蛋白質(zhì)的組分相對(duì)百分比T3>T2>T4>T1。 隨著秸稈比例的升高， 熒光組分相對(duì)百分比類蛋白質(zhì)>類富里酸>類胡敏酸。 D’Orazio等[18]研究表明， 木質(zhì)素含有多糖、 脂肪類成分， 有利于腐殖化過(guò)程并使芳香結(jié)構(gòu)成分增加， 發(fā)酵后， 牛糞中類蛋白物質(zhì)腐殖化程度和芳香性均升高， 類富里酸含量顯著增加。 本研究與其結(jié)果完全一致， 玉米秸稈中含有大量的纖維物質(zhì)(木質(zhì)素、 纖維素)， 在發(fā)酵腐殖化過(guò)程中， 類蛋白質(zhì)向類富里酸轉(zhuǎn)化， 進(jìn)一步向類胡敏酸轉(zhuǎn)化， 類胡敏酸所占比例大小體現(xiàn)物料的發(fā)酵程度。 發(fā)酵處理中T3的類胡敏酸組分相對(duì)比例最高， 說(shuō)明該處理發(fā)酵效果最好。

2.4 DOM熒光組分相關(guān)性分析

分析不同處理DOM的熒光組分相關(guān)性， 見(jiàn)表4， 當(dāng)秸稈-牛糞比例為6∶4時(shí)， 類胡敏酸熒光強(qiáng)度值及相對(duì)百分比最大， 且類富里酸和類胡敏酸呈極顯著正相關(guān)(p<0.01)， 類富里酸和類胡敏酸均與類蛋白質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。 熒光強(qiáng)度大小及組分間的相關(guān)性反映出有機(jī)物料發(fā)酵過(guò)程中物質(zhì)的轉(zhuǎn)化關(guān)系及方向， 為提高堆肥過(guò)程中秸稈利用率， 在確定合理的發(fā)酵物料配比時(shí)， 通過(guò)熒光組分的特性規(guī)律， 掌握一定的配比關(guān)系， 可為有機(jī)物料發(fā)酵生產(chǎn)有機(jī)肥提供一定的科學(xué)依據(jù)。 因此， 本研究秸稈-牛糞體積比為6∶4可作為生產(chǎn)實(shí)踐的參考。

表4 不同熒光組分間相關(guān)性Table 4 Correlations between differentfluorescence components

3 結(jié) 論

(1) 秸稈-牛糞發(fā)酵過(guò)程中DOM來(lái)源受自生源和外生源的共同影響， 因秸稈腐解時(shí)間較長(zhǎng)， 40 d時(shí)有機(jī)質(zhì)腐殖化程度尚較低； 秸稈-牛糞比例為6∶4時(shí)， 自生源特性較強(qiáng)， 且發(fā)酵末期腐殖化程度相對(duì)較高。

(2) DOM包含3種熒光組分： 類富里酸(紫外類富里酸和可見(jiàn)類富里酸)、 類胡敏酸、 類蛋白質(zhì)(類色氨酸和類酪氨酸)。

(3) 隨發(fā)酵時(shí)間， 類富里酸和類胡敏酸熒光強(qiáng)度均增強(qiáng)， 類蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度減弱； 其相對(duì)百分比和熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)一致。 總熒光強(qiáng)度隨發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)先增加后減少， 最后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)， 最大總熒光強(qiáng)度值出現(xiàn)在發(fā)酵第15 d。 隨著秸稈比例的升高， 熒光組分相對(duì)百分比： 類蛋白質(zhì)>類富里酸>類胡敏酸。 類富里酸和類胡敏酸呈極顯著正相關(guān)， 兩者均與類蛋白質(zhì)呈負(fù)相關(guān)。

(4) 秸稈-牛糞體積比為6∶4時(shí)， 類胡敏酸熒光強(qiáng)度及相對(duì)百分比最大， 可作為堆肥參考依據(jù)。