不同食用菌多糖復配物對RAW264.7 巨噬細胞的免疫調(diào)節(jié)作用

諶淑平，李明智，董 楠，徐德昌，陳曉敏，胡婕倫，鐘虹光，堯梅香，聶少平,*

（1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，中加食品科學技術聯(lián)合實驗室(南昌)，江西南昌 330047；2.江中食療科技有限公司，江西九江 330000）

機體的免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細胞和免疫分子組成，被分為天然免疫系統(tǒng)和適應性免疫系統(tǒng)，是人體重要的防御屏障[1]。正常的免疫反應可以通過對抗病原體并清除自身衰老、惡化、突變或死亡的細胞來維持機體的健康[2]。機體免疫系統(tǒng)的失調(diào)與機體的病理密切相關，例如過敏、炎癥、癌癥和腫瘤等[3]。

隨著人們健康意識的提高，食療已經(jīng)成為社會關注的焦點。作為一類重要的“食藥同源”食材，食用菌在我國膳食食譜中占有重要的一席[4]。食用菌具有改善血液微循環(huán)、降低膽固醇和提高肝臟解毒能力等活性作用。長期食用食用菌具有促進機體的新陳代謝、增強機體免疫等益處[5]，可達到較好的食療效果。多糖作為食用菌主要的有效成分之一，可通過刺激效應巨噬細胞而分泌細胞因子，進而調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)和相關免疫通路[6]。最新研究報道表明，大部分的食用菌多糖在免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗癌和護肝等方面具有顯著效果[7]。如銀耳、茯苓、香菇、猴頭菇和竹蓀作為食用菌，是人們餐桌的常客。這些食用菌中的多糖組分均已被證實能很好地調(diào)節(jié)機體免疫[8?15]。食用菌多糖資源豐富，并具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性，在開發(fā)增強機體免疫功能的產(chǎn)品方面具有明顯優(yōu)勢。

目前，國內(nèi)外對食用菌多糖的免疫調(diào)節(jié)活性大多基于某種多糖單獨作用的研究，對多糖復配物的免疫調(diào)節(jié)活性研究報道較少。食用菌多糖作為極具潛力的天然產(chǎn)物，探究不同食用菌多糖復配物的免疫調(diào)節(jié)活性，最大限度地發(fā)揮食用菌多糖的生物活性，擁有廣闊的開發(fā)前景。巨噬細胞是天然免疫系統(tǒng)中最重要的免疫細胞之一，它的活化被認為是刺激免疫系統(tǒng)的必要步驟[16]。本研究團隊前期初步發(fā)現(xiàn)5 種常見食用菌多糖（銀耳多糖、茯苓多糖、香菇多糖、猴頭菇多糖和竹蓀多糖）單獨作用于RAW264.7 時具有免疫調(diào)節(jié)活性，然而，這幾種食用菌進行復配后的免疫調(diào)節(jié)活性目前尚不清楚。因此，本實驗以巨噬細胞RAW264.7 為研究對象，探討5 種食用菌多糖中任意3 種進行復配得到的多糖復配物的免疫調(diào)節(jié)活性，實驗結果可豐富食用菌多糖的研究結果，也可為后期探究多糖復配物免疫調(diào)節(jié)活性機制提供參考數(shù)據(jù)，也為基于多糖復配物開發(fā)免疫調(diào)節(jié)功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

猴頭菇多糖、銀耳多糖 由江中食療科技有限公司哆糖君研究組提供；香菇多糖、茯苓多糖、竹蓀多糖 由南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室制備。以葡萄糖為標準品，苯酚-硫酸法檢測，猴頭菇多糖、銀耳多糖、香菇多糖、茯苓多糖和竹蓀多糖的多糖含量分別為92.97%、77.29%、71.00%、88.77%和95.25%；小鼠巨噬細胞RAW264.7 中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；DMEM 培養(yǎng)基、PBS 片劑 北京索萊寶公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS） Biological Industries（BI）公司；FITC-dextran 美國Sigma 公司；LPS 上海碧云天生物技術有限公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（enzymelinked immunosorbent assay, ELISA）試劑盒 武漢博士德公司；CCK-8 試劑盒 日本同仁公司。

Varioskan Flash 酶標儀、3110 Series II CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo 公司；3K15-高速冷凍離心機 德國Sigma 公司；CKX41 倒置顯微鏡 日本Olympus公司；CytoFLEX S 流式細胞儀 美國Buckman Coulter 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖復配物溶液的配制 培養(yǎng)基作溶劑，將5 種食用菌多糖均配制為濃度為320 μg/mL 的母液，任意3 種多糖按照1:1:1 的復配比配成多糖復配物溶液。然后由母液分別稀釋成160、80、40、20、10 和5 μg/mL 的溶液備用，復配方式如表1。

表1 食用菌多糖復配方式Table 1 Compound methods of edible fungi polysaccharides

1.2.2 細胞培養(yǎng)與分組 RAW264.7 巨噬細胞用含有10%（mL/mL）胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 U/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部80%時進行傳代。選取對數(shù)生長期細胞進行實驗，主要分為正常對照組，加入DMEM 培養(yǎng)基；陽性組，加入1 μg/mL 的LPS 培養(yǎng)基溶液共培養(yǎng)[16]；樣品組，加入不同濃度的多糖復配物培養(yǎng)基溶液處理。

1.2.3 增殖能力檢測 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞接種于96 孔板中，接種密度為1×105個/mL，每孔100 μL，37 ℃培養(yǎng)4～12 h 后棄去培養(yǎng)液。按照分組，正常組加入100 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，陽性組加入100 μL 含1 μg/mL LPS 的10%胎牛血清培養(yǎng)基，樣品組加入100 μL 含不同復配多糖的10%胎牛血清培養(yǎng)基，多糖復配物最終濃度為5、10、20、40、80、160 和320 μg/mL，另設只含培養(yǎng)基不含細胞的孔為陰性對照組。培養(yǎng)24 h 后棄去上清，每孔加入100 μL 含10% CCK-8 的培養(yǎng)液。培養(yǎng)1～4 h 后用酶標儀在450 nm 處測定吸光度[17]。細胞增殖率按式（1）計算：

式中，A0為陰性對照組吸光度，A1為正常對照組吸光度，A2為樣品組或陽性組吸光度。

通過對增殖率的計算，分析不同濃度多糖復配物溶液對RAW264.7 巨噬細胞存活率的影響，從而進一步確定樣品的濃度范圍。

1.2.4 TNF-α含量檢測 取對數(shù)生長期的RAW264.7細胞按每孔5×105個/mL 接種于24 孔板中，每孔500 μL，37 ℃培養(yǎng)4 h 后棄去培養(yǎng)液。按照分組，正常對照組中加入500 μL 含10%胎牛血清培養(yǎng)基溶液，陽性組加入500 μL 濃度為1 μg/mL LPS 的含10%胎牛血清培養(yǎng)基溶液，樣品組加入500 μL 不同濃度的多糖復配物的10%胎牛血清培養(yǎng)基溶液，多糖復配物的最終濃度為5、10、20、40、80 和160 μg/mL。培養(yǎng)12 h 后，收集上清液，ELISA 法測定TNF-α含量[18]。

1.2.5 細胞吞噬能力測定 參考文獻方法[19]，稍作修改，具體操作如下：將2 mL 細胞濃度為5×105個/mL的RAW264.7 巨噬細胞接種于6 孔細胞培養(yǎng)板中，于培養(yǎng)箱（37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng)4 h 后洗去未貼壁細胞。按照分組，正常對照組每孔分別加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，陽性組加入1 mL 1 μg/mL LPS 的10%胎牛血清培養(yǎng)基溶液，以及樣品組分別加入1 mL 濃度為40、80 和160 μg/mL 的不同復配多糖的10%胎牛血清培養(yǎng)基溶液。培養(yǎng)24 h 后棄上清，PBS 清洗2 次，各孔分別加入1 mL濃度為1 mg/mL FITC-dextran 培養(yǎng)基溶液，37 ℃孵育1 h，用冷PBS 中止反應，細胞清洗2 次，收集細胞于1.5 mL 的EP 管中，1000 r/min 離心5 min，棄去上清。向收集到的細胞中加入0.5 mL PBS 重懸，流式細胞儀檢測分析。

1.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)以mean±SD 表示，采用SPSS 20.0 統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析，利用Graph Pad 6.0 軟件對實驗結果進行作圖分析。P<0.05 時有顯著性差異，P<0.01 時有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同食用菌多糖復配物對巨噬細胞RAW264.7增殖能力的影響

巨噬細胞體外增殖能力的檢測是評價巨噬細胞免疫調(diào)節(jié)功能的常用方法[20]。如圖1 所示，與正常對照組相比，除了320 μg/mL 的復配多糖308、309 和310 外，其他不同濃度復配多糖均可以顯著促進巨噬細胞RAW264.7 的增殖（P<0.05，P<0.01），且每個復配多糖最佳劑量的效果都優(yōu)于陽性LPS 組。除了復配多糖306（圖1f），其他復配方式的多糖復配物最高劑量320 μg/mL 的效果均最差，這個結果與之前報道的高濃度的廣葉繡球菌β-D-葡聚糖抑制RAW264.7 增殖的結果相似[21]，推測可能是高濃度的多糖復配物溶液滲透壓較高，引起巨噬細胞活性抑制，也可能是多糖誘導巨噬細胞過度活化，功能紊亂。復配多糖303 促進巨噬細胞增殖效果強于其他復配多糖（圖1c），濃度為10 μg/mL 時效果最好。綜合目前已有報道，促進巨噬細胞增殖是多糖刺激巨噬細胞途徑之一[22?23]。本實驗結果表明，5 種食用菌多糖的任意3 種進行復配得到的多糖復配物均可顯著刺激巨噬細胞RAW264.7 的增殖（P<0.05），從而提高巨噬細胞的免疫功能。

圖1 不同食用菌多糖復配物對巨噬細胞RAW264.7 增殖能力的影響Fig.1 Effect of different edible fungi polysaccharide complex on the proliferation of macrophage RAW264.7

2.2 不同食用菌多糖復配物對巨噬細胞RAW264.7分泌TNF-α 能力的影響

激活的巨噬細胞可產(chǎn)生多種細胞因子來調(diào)節(jié)細胞和體液免疫反應，如TNF-α、IL-2 和IFN-γ[24]。腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor, TNF）-α是自身免疫性疾病中重要的炎癥介質(zhì)，能夠活化T 細胞，并介導中性粒細胞聚集，刺激吞噬行為的產(chǎn)生，也會影響活化的巨噬細胞分泌IL-6 和IL-8 等炎癥因子[25?26]。因此，本研究中選定其作為評價的代表性重要指標。另外根據(jù)對巨噬細胞RAW264.7 增殖率的測定，確定了檢測多糖復配物的濃度為5、10、20、40、80 和160 μg/mL 對TNF-α分泌水平的影響。表2 為不同濃度的多糖復配物對RAW264.7 細胞分泌TNF-α的結果。結果表明，空白對照組巨噬細胞RAW264.7 的培養(yǎng)液中幾乎不含細胞因子TNFα（0.079±0.037 ng/mL），而 陽 性LPS 組（13.790±3.999 ng/mL）和不同濃度的復配多糖溶液處理后的細胞培養(yǎng)液中TNF-α含量極顯著升高（P<0.01）。此結果與之前報道的5 種食用菌多糖均能顯著促進RAW264.7 分泌TNF-α[27]一致。所有復配多糖的最優(yōu)劑量促進RAW264.7細胞分泌TNF-α的效果均強于陽性LPS。此結果表明復配多糖溶液能促進TNF-α的分泌。此外，復配多糖304、復配多糖305和復配多糖306 這3 種多糖復配物皆劑量依賴性促進RAW264.7 細胞分泌TNF-α。其中，160 μg/mL的復配多糖301 和10 μg/mL 的復配多糖303 處理的RAW264.7 細胞的培養(yǎng)液中TNF-α含量最高，分別為76.520±9.102、75.180±12.600 ng/mL。表明10 種多糖復配物均可以顯著激活RAW264.7 細胞，使其TNF-α的分泌量顯著增加，160 μg/mL 的復配多糖301 和10 μg/mL 的復配多糖303 的促進效果最強。

表2 不同種食用菌多糖復配物對巨噬細胞RAW264.7 分泌TNF-α 能力的影響Table 2 Effect of different edible fungi polysaccharide complex on the levels of TNF-α secreted by macrophage RAW264.7

2.3 不同種食用菌多糖復配物對巨噬細胞RAW264.7吞噬能力的影響

巨噬細胞的吞噬功能是機體防衛(wèi)外來異物侵入的主要機制之一，可直接或間接地體現(xiàn)巨噬細胞的免疫應答能力[28?30]。本研究采用流式細胞儀檢測巨噬細胞RAW264.7 吞噬FITC-dextran 評價細胞的吞噬能力[31]。分析不同濃度的復配多糖對RAW264.7增殖能力和TNF-α分泌量影響的檢測結果發(fā)現(xiàn)，在濃度為40、80 和160 μg/mL 時，復配多糖促進RAW 264.7 的增殖和TNF-α的分泌具有顯著性和穩(wěn)定性。因此本實驗選定這3 個濃度作為檢測復配多糖對RAW264.7 吞噬能力影響的檢測濃度。圖2 展示的是不同食用菌多糖復配物對巨噬細胞RAW 264.7 吞噬FITC-dextran 的平均熒光強度的影響。與正常對照組相比，不同濃度的復配多糖均能極顯著增加RAW 264.7 吞噬的FITC-dextran 的平均熒光強度（P<0.01），表明不同濃度的復配多糖均能極顯著增強巨噬細胞的吞噬能力（P<0.01）。有研究通過流式細胞儀檢測食用菌喇叭菌多糖處理后巨噬細胞吞噬的FITC-dextran 平均熒光強度發(fā)現(xiàn)喇叭菌多糖顯著增強RAW264.7 的吞噬能力[32]，這與本實驗的結果一致。除復配多糖303、復配多糖304、復配多糖306 和復配多糖309 這4 種復配物外，其他6 種復配物增強巨噬細胞的吞噬能力均呈現(xiàn)劑量依賴性。10 種復配方式中，復配多糖301（銀耳多糖、茯苓多糖和香菇多糖）增強巨噬細胞吞噬能力的效果最好，且濃度為160 μg/mL 時的促進效果（149350±2071）強于陽性LPS 組（116978±4233）。實驗結果表明，40、80 和160 μg/mL 的多糖復配物均能極顯著增強巨噬細胞RAW264.7 的吞噬能力（P<0.01）。

圖2 不同食用菌多糖的復配物對巨噬細胞RAW264.7 吞噬能力的影響Fig.2 Effect of different edible fungi polysaccharide complex on the phagocytic ability of macrophage RAW264.7

3 結論

基于5 種食用菌多糖（銀耳多糖、茯苓多糖、香菇多糖、猴頭菇多糖和竹蓀多糖）中的任意3 種多糖復配得到的10 種多糖復配物可通過促進巨噬細胞RAW264.7 的增殖、TNF-α的分泌以及增強巨噬細胞吞噬能力來實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)作用。其中基于銀耳多糖、茯苓多糖和竹蓀多糖的復配多糖303 促進巨噬細胞增殖的效果最好，基于銀耳多糖、茯苓多糖和香菇多糖的復配多糖301 以及基于銀耳多糖、茯苓多糖和竹蓀多糖的復配多糖303 在提高TNF-α分泌水平上效果最好，基于銀耳多糖、茯苓多糖和香菇多糖的復配多糖301 增強巨噬細胞的吞噬能力呈現(xiàn)了最強的效果。本研究結果可為以后深入研究不同食用菌多糖復配物的免疫調(diào)節(jié)機制奠定基礎，也可為開發(fā)不同食用菌多糖復配物的相關健康產(chǎn)品提供理論依據(jù)。