橡子仁萃取物成分分析及對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用

梁宗瑤，魏園園，任維維，李珉夢(mèng)，劉 婧，段旭昌

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100）

橡子含多種活性成分，如蛋白質(zhì)、游離氨基酸、微量元素、礦物質(zhì)等[1?3]，另外，多酚類(lèi)物質(zhì)含量較高，具有極佳的保健功能，如抗氧化、抑菌、抗癌、抗衰老、降血壓、降血糖、保護(hù)神經(jīng)、預(yù)防心血管疾病等[4?9]。II 型糖尿?。═IIDM）是一種全球流行的代謝和內(nèi)分泌失調(diào)疾病，主要表現(xiàn)為餐后高血糖和胰島素抵抗（IR），碳水化合物攝入后，在小腸α-淀粉酶作用下水解為寡糖，進(jìn)而在α-葡萄糖苷酶作用下水解為葡萄糖，引起血糖升高。因此，抑制這兩種酶的活性，延緩碳水化合物消化和葡萄糖進(jìn)入血液的速率，被認(rèn)為是控制餐后高血糖的有效途徑[10?12]。

橡子中目前常用的α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性抑制藥物，如阿卡波糖、米格列醇等會(huì)引起人體腸胃脹氣、腹瀉、腹部和肝臟疾病[13]等癥狀，因此尋找副作用小的天然酶活抑制成分已成為目前糖尿病治療藥物篩選的研究熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物中多酚、黃酮、磷脂酸類(lèi)物質(zhì)均能夠作為α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性抑制劑起到降血糖作用[14?15]。據(jù)報(bào)道，橡子提取物中多數(shù)化合物，尤其是三萜類(lèi)化合物，對(duì)α-葡萄糖苷酶和PTB1B 有較強(qiáng)抑制作用，橡子內(nèi)所富含的多酚物質(zhì)對(duì)降低體內(nèi)血糖濃度有明顯的效果，可用于緩解糖尿病相關(guān)的癥狀[16?18]，但具體抑制機(jī)理仍不明確。

為探索橡子仁多酚的降血糖活性，開(kāi)發(fā)其天然藥用價(jià)值，本文以新鮮栓皮櫟橡子仁為材料，通過(guò)紫外吸收光譜、高效液相色譜對(duì)萃取組分進(jìn)行分析，并研究其對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的體外抑制作用，以期為橡子仁降血糖功能食品開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

栓皮櫟橡子 2018 年9 月采收于陜西省楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)樹(shù)木園；沒(méi)食子酸、表沒(méi)食子兒茶素、綠原酸、兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、阿魏酸、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、根皮素（均為色譜純，純度≥98%）、α-葡萄糖苷酶（1 kU/13.4 mg）、α-淀粉酶（3700 U/g）、α-葡萄糖苷酶試劑盒、α-淀粉酶試劑盒、（4-硝基苯基）-a-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）、對(duì)硝基苯酚（PNP）、DNS 試劑 北京索萊寶科技有限公司；可溶性淀粉、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯、正丁醇、溴化鉀、冰醋酸 均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司；甲醇、乙腈 色譜純，美國(guó)TEDIA 公司。

Y1-050ST 型超聲清洗機(jī) 河北德科機(jī)械科技有限公司；LGJ-100 型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)儀器公司；UV-2550 型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；1260 型高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；victorX3 型多功能酶標(biāo)儀 珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司；F-7000 型熒光分光光度計(jì) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 橡子仁萃取物制備 新鮮栓皮櫟橡子挑選、洗凈后45 ℃熱風(fēng)烘干72 h，殼仁分離，橡子仁粉碎過(guò)80 目篩，避光保存?zhèn)溆?；取適量橡子仁粉，按料液比1:5（g/mL）加入體積濃度為50%的乙醇溶液，40 ℃下超聲提取60 min，過(guò)濾，濾渣以相同方式提取兩次，合并濾液，45 ℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至粘稠，冷阱?50 ℃，真空冷凍干燥至恒重，得橡子仁粗提物。取適量橡子仁粗提物，配制為1 mg/mL 水溶液，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，依次用1:50（V/V）的乙酸乙酯、正丁醇連續(xù)各萃取三次，收集乙酸乙酯萃取液、正丁醇萃取液和剩余水相，分別真空旋轉(zhuǎn)濃縮至膏狀，45 ℃真空干燥，研磨成粉，得橡子仁乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物[19]。

式中，m1為粗提物/萃取物質(zhì)量，m2為提取前原料質(zhì)量。

1.2.2 萃取物成分分析

1.2.2.1 紫外光譜分析 三種橡子仁萃取物分別配制成1.0 mg/mL 乙醇溶液，適當(dāng)稀釋后，以無(wú)水乙醇為空白，以沒(méi)食子酸為對(duì)照，190～800 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，推斷其結(jié)構(gòu)組成。

1.2.2.2 高效液相色譜分析 沒(méi)食子酸、表沒(méi)食子兒茶素、綠原酸、兒茶素、表兒茶素、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、阿魏酸、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、根皮素標(biāo)準(zhǔn)品用色譜甲醇配制為1 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)液，梯度稀釋?zhuān)^(guò)0.45 μm 有機(jī)濾膜，備用。

橡子仁乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物用色譜甲醇配制為10 mg/mL 溶液，過(guò)0.45 μm 有機(jī)濾膜，備用。

色譜條件[20]：色譜柱：反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相A 為0.1%乙酸水溶液，流動(dòng)相B 為乙腈；流速1 mL/min；檢測(cè)器波長(zhǎng)280 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；梯度洗脫程序：0 min，A:B 為97:3；20 min，A:B 為95:5；35 min，A:B 為85:15；50 min，A:B 為70:30%；65 min，A:B 為70:30；75 min，A:B 為100:0。

1.2.3α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性抑制試驗(yàn)

1.2.3.1 酶活性抑制率測(cè)定 三種橡子仁萃取物、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、PNPG 均溶于磷酸緩沖液（0.1 mol/L，pH6.8）。

將150 μLα-淀粉酶液（0.148 U/mL）與150 μL樣品液（20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 mg/mL）混勻，37 ℃水浴10 min 后，分別加入250 μL 可溶性淀粉溶液（1%），37 ℃孵育10 min，再加入DNS 試劑500 μL，沸水浴反應(yīng)5 min，冷卻后測(cè)其540 nm 處OD 值，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算抑制率及IC50值[21]。

將5 μLα-葡萄糖苷酶液（1.5 U/mL）與5 μL 樣品 液（ 5、 2.5、 1.25、 0.625、 0.3125、 0.15625、0.078125 mg/mL）、50 μLPNPG 溶液（5 mmol/L）、50 μL磷酸緩沖液混勻，37 ℃反應(yīng)30 min，加入0.2 mol/L碳酸鈉終止反應(yīng)，測(cè)其405 nm 處OD 值，以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照，計(jì)算酶活抑制率及IC50值[22]。

式中：Aa為樣品組吸光度；Ab為樣品背景組吸光度（等體積緩沖液替代酶液）；Ac為對(duì)照組吸光度（等體積緩沖液替代樣品液）；Ad為對(duì)照背景組吸光度（等體積緩沖液替代樣品和酶液）。

1.2.3.2 酶抑制動(dòng)力學(xué)試驗(yàn) 固定α-淀粉酶濃度（0.148 U/mL），改變底物可溶性淀粉濃度（0.50%、0.75%、1%、1.25%、1.50%），測(cè)定不同萃取物濃度（0、5、10 mg/mL）下酶促反應(yīng)速率；固定α-葡萄糖苷酶濃度（1.5 U/mL），改變底物PNPG 濃度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mmol/L），測(cè)定不同萃取物濃度（0、0.63、1.25 mg/mL）下酶促反應(yīng)速率。以反應(yīng)速率倒數(shù)（1/V）對(duì)底物濃度倒數(shù)（1/S）作圖，得Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線圖，判斷橡子仁萃取物對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制類(lèi)型，并計(jì)算抑制常數(shù)[23?25]。

1.2.3.3 酶熒光光譜分析α-淀粉酶溶液（0.148 U/mL）與不同濃度（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL）的三種萃取物溶液混勻，α-葡萄糖苷酶溶液（1.5 U/mL）與不同濃度（0、0.005、0.025、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL）的三種萃取物混勻，分別在激發(fā)波長(zhǎng)285 nm 和290 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫均為10 nm 得條件下，以PBS 為空白，測(cè)定混合體系300～500 nm 范圍內(nèi)的熒光光譜，分析萃取物與α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的相互作用[26?27]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)處理平行測(cè)定3 次，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用Excel 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用OriginPro 9.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡子仁萃取物制備

100 g 橡子仁粉可得乙醇粗提物40.3 g，得率為40.3%；100 g 乙醇粗提物乙酸乙酯、正丁醇、水連續(xù)萃取分離，得乙酸乙酯萃取物23.8 g，正丁醇萃取物34.3 g，水萃取物30.0 g，萃取得率分別為23.8%、34.3%、30.0%，損失率為11.9%。

2.2 橡子仁萃取物紫外吸收光譜分析

橡子仁乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物及對(duì)照沒(méi)食子酸的紫外吸收光譜測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1 可知：乙酸乙酯萃取物的紫外吸收光譜在211 nm 處出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰，在254、364 nm 處有微弱吸收，符合黃酮類(lèi)和縮合單寧類(lèi)物質(zhì)的紫外吸收特性[28]，證明橡子仁乙酸乙酯萃取物中可能含有黃酮和縮合單寧類(lèi)物質(zhì)；正丁醇萃取物在213、254 和364 nm 處出現(xiàn)吸收峰，與沒(méi)食子酸紫外吸收?qǐng)D譜極其相似，說(shuō)明其中主要含有水解單寧；水萃取物在364 nm 處有一微弱的吸收峰，與苯丙素類(lèi)物質(zhì)吸收特征相近，說(shuō)明其中可能含有少量苯丙素類(lèi)物質(zhì)[28]，由圖可知，橡子仁乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物均具有酚類(lèi)物質(zhì)的吸收特征。

圖1 橡子仁萃取物和沒(méi)食子酸的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV spectrum of acorn nutlet extractions and gallic acid

2.3 高效液相色譜分析

10 種標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC 色譜圖見(jiàn)圖2，回歸方程見(jiàn)表1，以此為對(duì)照分析3 種橡子仁萃取物的成分組成。

表1 10 種多酚類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)品溶液回歸方程Table 1 Regression equations of 10 kinds of polyphenols standard solution

圖2 10 種多酚標(biāo)品的HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC profiles of 10 kinds of polyphenols standard solution

乙酸乙酯萃取物的HPLC 分析結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3 可知，橡子仁乙酸乙酯萃取物在11.751、33.54、38.705、 40.937、 45.053、 50.066、 51.859、 55.729、70.276 min 出現(xiàn)9 個(gè)吸收峰，說(shuō)明其最少含有9 種不同物質(zhì)。與已知標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，橡子仁乙酸乙酯萃取物中含有沒(méi)食子酸、沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、根皮素五種物質(zhì)，含量分別為14.951、4.829、28.228、1.170、0.961 mg/g，及其他四種未知成分。

圖3 橡子仁乙酸乙酯萃取物的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC profiles of acorn nutlet ethyl acetate phase extraction

橡子仁正丁醇萃取物的HPLC 圖譜見(jiàn)圖4。由圖4 可知，正丁醇萃取物在5.657、7.591、8.447、9.146、 11.819、 13.096、 18.391、 23.732、 28.240、31.942、 34.398、 38.017、 40.881、 44.806、 46.905、69.463 min 出現(xiàn)16 個(gè)明顯的檢測(cè)峰，說(shuō)明該組分中至少含有16 種成分。與已知標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，可判斷正丁醇萃取物中表兒茶素沒(méi)食子酸酯含量最高，達(dá)5.633 mg/g，還有一定量的兒茶素和沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，含量分別為5.024、2.703 mg/g，以及其他13 種未知成分。

圖4 橡子仁正丁醇萃取物的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC profiles of acorn nutlet N-butanol phase extraction

橡子仁水萃取物的HPLC 圖譜見(jiàn)圖5。由圖5可知，該物質(zhì)在3.521、4.237、4.807、5.763、7.711、8.962、 10.055、 11.452、 15.023、 17.109、 19.451、21.488、 23.165、 28.769、 30.068、 41.883、 42.722、43.661、45.940、46.598、48.275 min 出現(xiàn)21 個(gè)較明顯吸收峰，與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比，初步判斷該物質(zhì)含有沒(méi)食子酸和綠原酸，含量分別為2.483、8.707 mg/g，另外仍含有19 種未知成分。

圖5 橡子仁水萃取物的HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC profiles of acorn nutlet water phase extraction

2.4 α-淀粉酶活性抑制結(jié)果分析

2.4.1α-淀粉酶活性抑制率測(cè)定結(jié)果 三種橡子仁萃取物和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶活性的抑制作用效果圖見(jiàn)圖6。由圖6 可知，三種萃取物對(duì)α-淀粉酶活性的抑制率隨濃度的增加而增大，當(dāng)萃取物濃度大于10 mg/mL 時(shí)，抑制率趨于穩(wěn)定。通過(guò)比較三種橡子仁萃取物和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的半抑制濃度（表2）可知，三種橡子仁萃取物和阿卡波糖抑制α-淀粉酶活性的強(qiáng)弱順序?yàn)椋喊⒖úㄌ?乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>水萃取物，乙酸乙酯與正丁醇萃取物抑制能力相差不大，僅為陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖的1/10，但遠(yuǎn)強(qiáng)于水萃取物，這可能是因?yàn)闆](méi)食子酰基的存在。乙酸乙酯和正丁醇萃取物中的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、兒茶素均為含有沒(méi)食子?；姆宇?lèi)物質(zhì),其可能通過(guò)氫鍵和ππ 共軛作用力與酶活性位點(diǎn)氨基酸殘基互相作用，進(jìn)而抑制酶活性[29]。三種橡子仁萃取物均表現(xiàn)出較強(qiáng)的α-淀粉酶抑制能力，但仍不及阿卡波糖。

表2 橡子仁萃取物和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的IC50 值Table 2 The IC50 value of acorn nutlet extraction and acarbose on α-amylase

圖6 橡子仁萃取物和阿卡波糖對(duì)α-淀粉酶的抑制作用Fig.6 α-amylase inhibitory activities of acorn nutlet extraction and acarbose

2.4.2α-淀粉酶抑制動(dòng)力學(xué)分析 三種橡子仁萃取物抑制α-淀粉酶的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線見(jiàn)圖7。由圖7A 可知，隨著乙酸乙酯萃取物濃度的增加，Vmax減小，Km不變，直線相交于x 軸上一點(diǎn)，表明橡子仁乙酸乙酯萃取物對(duì)α-淀粉酶的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制，抑制常數(shù)Ki為8.101 mg/mL。由圖7B、C 可知，隨著萃取物濃度的增加，Km變大，Vm變小，圖中直線均相交于第二象限中一點(diǎn)，因此橡子仁正丁醇、水萃取物對(duì)α-淀粉酶的抑制作用均為混合型抑制，Ki值分別為4.047 和2.173 mg/mL，Kis值分別為6.001 和3.308 mg/mL。橡子仁正丁醇萃取物和水萃取物的Ki均小于Kis，說(shuō)明萃取物與α-淀粉酶的結(jié)合強(qiáng)度大于其與α-淀粉酶-淀粉復(fù)合物的結(jié)合強(qiáng)度。

圖7 橡子仁乙酸乙酯萃取物（A）、正丁醇萃取物（B）和水萃取物（C）抑制α-淀粉酶的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線Fig.7 Lineweaver-Burk plots for α- amylase by acorn nutlet ethyl acetate phase extraction(A)、N-butanol phase extraction(B)and water phase extraction(C)

2.4.3α-淀粉酶熒光光譜分析 采用熒光猝滅試驗(yàn)分析橡子仁萃取物與α-淀粉酶之間的相互作用，試驗(yàn)結(jié)果如圖8 所示。由圖8 可知，在285 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下，α-淀粉酶在339 nm 處有熒光峰值，隨著三種萃取物濃度的升高，α-淀粉酶的熒光強(qiáng)度均降低，說(shuō)明萃取物與α-淀粉酶之間存在相互作用。另外，峰的位置沒(méi)有發(fā)生明顯的紅移或藍(lán)移，說(shuō)明橡子仁萃取物并未改變?chǔ)?淀粉酶氨基酸殘基的疏水性環(huán)境，而且萃取物與α-淀粉酶的結(jié)合復(fù)合物沒(méi)有熒光特性[30]。

圖8 橡子仁乙酸乙酯萃取物（A）、正丁醇萃取物（B）和水萃取物（C）與α-淀粉酶反應(yīng)的熒光光譜Fig.8 Fluorescence spectra of alpha-amylase in the presence of ethyl acetate phase extraction(A)、N-butanol phase extraction(B)and water phase extraction(C)

考慮到三種橡子仁萃取物為混合物，將沒(méi)食子酸（170 Da）分子量用于三種橡子仁萃取物分子量的估算，三種橡子仁萃取物對(duì)α-淀粉酶的Stern-Volmer 曲線見(jiàn)圖9，計(jì)算得出乙酸乙酯、正丁醇和水萃取物對(duì)α-淀粉酶的猝滅常數(shù)Kq分別為1.858×1011、4.049×1011、1.346×1011L/（mol·s），均大于各種猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞常數(shù)，表明三種萃取物以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)α-淀粉酶的猝滅均是靜態(tài)猝滅，但正丁醇萃取物和水萃取物的Stern-Volmer 曲線向y 軸彎曲，說(shuō)明這兩個(gè)樣品對(duì)α-淀粉酶的猝滅類(lèi)型可能是靜態(tài)猝滅為主、動(dòng)態(tài)猝滅為輔的混合猝滅[31]，而乙酸乙酯萃取物的熒光猝滅類(lèi)型為分子間結(jié)合引起的靜態(tài)猝滅。

圖9 橡子仁乙酸乙酯萃取物（A）、正丁醇萃取物（B）和水萃取物（C）對(duì)α-淀粉酶熒光猝滅的Stern-Volmer 曲線Fig.9 The Stern-Volmer plots for the fluorescence quenching of ethyl acetate phase extraction（A）、-butanol phase extraction（B）and water phase extraction(C) on α-amylase

2.5 α-葡萄糖苷酶活性抑制結(jié)果分析

2.5.1α-葡萄糖苷酶活性抑制率測(cè)定結(jié)果 三種橡子仁萃取物和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制效果見(jiàn)圖10。如圖10 所示，隨著樣品濃度增加，三種萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制率不斷變大，萃取物濃度為2 mg/mL 時(shí)，抑制率趨于穩(wěn)定。通過(guò)比較三種橡子仁萃取物和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50值（表3）可知,三種橡子仁萃取物和阿卡波糖抑制α-葡萄糖苷酶活性的強(qiáng)弱順序?yàn)椋阂宜嵋阴ポ腿∥?阿卡波糖>正丁醇萃取物>水萃取物，乙酸乙酯萃取物抑制能力強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖，說(shuō)明其可作為有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑，而正丁醇、水萃取物雖不如阿卡波糖，但仍具有較強(qiáng)抑制α-葡萄糖苷酶活性。

圖10 橡子仁萃取物和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.10 α-glucosidase inhibitory activities of acorn nutlet extraction and acarbose

表3 橡子仁萃取物和阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50 值Table 3 The IC50 of acorn nutlet extraction and acarbose on αglucosidase

2.5.2α-葡萄糖苷酶抑制動(dòng)力學(xué)分析 橡子仁萃取物抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線見(jiàn)圖11。由圖11 可知，隨著三種橡子仁萃取物濃度的增大，Km和Vm均變小，三組直線均相交于第三象限中一點(diǎn)，所以乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物的抑制作用類(lèi)型均為混合型抑制，Ki和KIS值分別為1.187 和 0.045 mg/mL、 0.843 和 0.039 mg/mL、3.314 和0.414 mg/mL；Ki值均遠(yuǎn)大于Kis值，說(shuō)明三種萃取物與α-葡萄糖苷酶-PNPG 復(fù)合物的結(jié)合均強(qiáng)于萃取物與α-葡萄糖苷酶的結(jié)合。

圖11 橡子仁乙酸乙酯萃取物（A）、正丁醇萃取物（B）和水萃取物（C）抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk 雙倒數(shù)曲線Fig.11 Lineweaver-Burk plots for α- glucosidase by acorn nutlet ethyl acetate phase extraction(A)、N-butanol phase extraction(B) and water phase extraction(C)

2.5.3α-葡萄糖苷酶熒光光譜分析 如圖12 所示，在290 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下，α-葡萄糖苷酶在338 nm 處出現(xiàn)發(fā)光峰值，隨著萃取物濃度的增加，混合體系熒光強(qiáng)度下降，猝滅作用明顯，說(shuō)明萃取物與α-葡萄糖苷酶之間存在相互作用；且熒光光譜發(fā)生輕微紅移，表明萃取物與α-葡萄糖苷酶作用后，酶的構(gòu)象發(fā)生變化，改變了酶分子中酪氨酸、色氨酸所處微環(huán)境的極性，使疏水性減弱，親水性提高，從而使酶的催化活性降低[32]。

圖12 橡子仁乙酸乙酯萃取物（A）、正丁醇萃取物（B）和水萃取物（C）與α-葡萄糖苷酶反應(yīng)的熒光光譜Fig.12 Fluorescence spectra of alpha-glucosidase in the presence of ethyl acetate phase extraction(A)、N-butanol phase extraction(B) and water phase extraction(C)

三種橡子仁萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的Stern-Volmer 曲線見(jiàn)圖13，計(jì)算得出三種萃取物的Kq分別為3.070×1012、1.899×1012、1.062×1012L/（mol·s），遠(yuǎn)大于各種猝滅劑對(duì)生物大分子的最大擴(kuò)散碰撞常數(shù)，且三種萃取物的Stern-Volmer 曲線均彎向y 軸，說(shuō)明三種橡子仁萃取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的熒光猝滅類(lèi)型均為靜態(tài)猝滅為主、動(dòng)態(tài)猝滅為輔的混合猝滅，原因可能是三種橡子仁萃取物均是多種活性物質(zhì)的混合物，組成成分復(fù)雜，對(duì)酶的猝滅機(jī)制也比較復(fù)雜。

圖13 橡子仁乙酸乙酯萃取物（A）、正丁醇萃取物（B）和水萃取物（C）對(duì)α-葡萄糖苷酶熒光猝滅的Stern-volmer 曲線Fig.13 The Stern-Volmer plots for the fluorescence quenching of ethyl acetate phase extraction（A）、N-butanol phase extraction（B）and water phase extraction(C) on alpha-glucosidase

3 結(jié)論

橡子仁經(jīng)超聲輔助乙醇浸提，粗提物得率40.3%，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取，乙酸乙酯萃取物得率23.8%、正丁醇萃取物34.3%、水萃取物30.0%。紫外光譜結(jié)果表明，橡子仁乙酸乙酯、正丁醇、水萃取物化學(xué)結(jié)構(gòu)具有高度相似性，具有酚類(lèi)物質(zhì)的紫外吸收特征。HPLC 分析證明乙酸乙酯萃取物中至少含9 種物質(zhì)，正丁醇萃取物中至少含16 種物質(zhì)，水萃取物中至少含21 種物質(zhì)，但三種萃取物仍存在未知成分。橡子仁乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物、水萃取物對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性均有明顯抑制作用，酶抑制類(lèi)型多為混合型抑制，熒光猝滅多是靜態(tài)猝滅為主，動(dòng)態(tài)猝滅為輔的混合猝滅。橡子仁萃取物的酶抑制類(lèi)型與前人報(bào)道的競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型[16]有所不同，可能是橡子品種和提取溶劑不同所致；另外，萃取物中部分物質(zhì)仍不明確，需進(jìn)一步分析進(jìn)行確定，且可通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步探索萃取物的降血糖活性，為橡子萃取物降血糖藥品或保健食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。