核激素受體家族在皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中的表達(dá)

劉林紅，張 華，張 穎，胡美玲，張 斌※

（1.重慶市中醫(yī)院皮膚科，重慶 400011；2.山東省濟(jì)南市天橋區(qū)疾病預(yù)防控制中心，山東 濟(jì)南 250031）

皮膚鱗狀細(xì)胞癌簡稱皮膚鱗癌，是最常見的皮膚惡性腫瘤，來源于皮膚表皮細(xì)胞或者皮膚附屬器，易在皮膚表面形成潰瘍，損毀患者容貌，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量、威脅患者健康[1]。鱗癌的確切發(fā)病機(jī)制目前仍不十分清楚[2]。研究發(fā)現(xiàn)，核激素受體家族成員在調(diào)節(jié)皮膚發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖、分化、凋亡等作用并參與了炎癥反應(yīng)，而其參與調(diào)節(jié)細(xì)胞過程的能力，也讓其成為調(diào)節(jié)人類皮膚疾病的有力的作用靶點(diǎn)[3-5]。

前期研究發(fā)現(xiàn)，皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞中存在大量核激素受體家族成員的表達(dá)，提示表皮是核激素受體的主要靶器官[6]。作為表皮來源的惡性腫瘤，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中，核激素受體的表達(dá)水平如何？與正常細(xì)胞相比，兩者之間受體的表達(dá)是否存在差別？這種表達(dá)差異的了解無論對于了解鱗癌的發(fā)病機(jī)制或?qū)δ[瘤治療都具有重要意義。因此，本研究采用正常角質(zhì)形成細(xì)胞作為對照，觀察皮膚鱗癌A431細(xì)胞中核激素受體的表達(dá)情況，探索核激素受體在正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞表達(dá)的差異，旨在加深對皮膚腫瘤發(fā)生的機(jī)制了解，以選擇性地采用更有效的靶向藥物，改善臨床治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人皮膚正常角質(zhì)形成細(xì)胞和人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株A431細(xì)胞購自美國組織培養(yǎng)庫（American Tissue Culture Collection）。DMEM培養(yǎng)基（美國HyClone公司）、角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基（ATCC）、青霉素-鏈霉素溶液（美國Cellgro公司）、RNeasy Mini試劑盒、RT2 First Strand試劑盒、RT2 SYBR Green qPCR Mastermix和RT2 Profiler PCR Array Plate（美國Qiagen公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 ① 細(xì)胞培養(yǎng)：在37℃、含5%CO2及飽和濕度的孵箱中，用細(xì)胞專用培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，每2天更換培養(yǎng)液1次，當(dāng)單層培養(yǎng)的細(xì)胞達(dá)到大于90%融合時(shí)，按細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)用0.25%胰蛋白酶液+0.02%乙二胺四乙酸消化細(xì)胞，用于傳代，鏡下觀察，及時(shí)用胰蛋白酶終止液終止消化。② 細(xì)胞RNA的提取、逆轉(zhuǎn)錄、Real-time PCR：以每孔2×105細(xì)胞濃度將角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚鱗狀細(xì)胞癌A431細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞接近90%融合時(shí)，裂解細(xì)胞后提取RNA。使用Nanodrop 2000微量紫外分光光度計(jì)（美國Thermo公司）分別測定波長為260nm與280nm（A260和A280）條件下RNA樣本的吸光度值，系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算RNA濃度（待測樣本A260/A280比值在1.8～2.0范圍內(nèi)，提示RNA純度較高）。提取的RNA參照RT試劑盒（RT2 First Strand Kit）說明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（reverse transcription,RT）反應(yīng)。按照RT2 Profiler PCR Array Plate試劑盒的操作說明配置反應(yīng)體系，使用LightCycler 480II實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用2-△△CT法對基因表達(dá)變化進(jìn)行相對比較分析。從PCR系統(tǒng)中獲取原始CT值后，帶入EXCEL中計(jì)算各自基因的相對表達(dá)量?！鰿T=CT靶基因-CT內(nèi)參照基因，2-△CT所得數(shù)值即為各自基因的相對表達(dá)水平[7]。△△CT=△CTA431—△CTKC，2-△△CT所得數(shù)值即為皮膚鱗癌A431細(xì)胞中與正常角質(zhì)形成細(xì)胞相比，各對應(yīng)核激素受體基因mRNA表達(dá)水平的倍數(shù)變化。

2 結(jié)果

2.1 正常人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中核激素受體家族成員的表達(dá) 正常人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中均有核激素受體家族成員的表達(dá)，按照基因表達(dá)值的高低，可見正常角質(zhì)形成細(xì)胞不同強(qiáng)度表達(dá)的基因在A431細(xì)胞中有不同的變化趨勢（見表1、圖1）。A431細(xì)胞中表達(dá)量較高的受體中以RXR二聚體家族成員為主，如VDR、RXR、RAR、PPAR以及LXR等，還包括數(shù)個(gè)孤兒受體，如NR2F2、NR2C1、NR2C2、NR1D2等（見圖2）。

圖1 角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中核激素受體mRNA相對表達(dá)量（2-△CT）

圖2 皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中核激素受體mRNA相對表達(dá)量（2-△CT）

表1 角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中核激素受體的相對表達(dá)量（±s）

表1 角質(zhì)形成細(xì)胞和皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中核激素受體的相對表達(dá)量（±s）

角質(zhì)形成細(xì)胞 皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞A431 NR2F2 0.954 0±0.031 2.994 0±0.252 2 VDR 0.946 5±0.063 7 0.894 3±0.078 6 RXRα 0.847 7±0.001 4 3.899 9±0.506 4 NR3C1(GRα) 0.625 1±0.100 8 0.625 7±0.041 PPARδ 0.571 1±0.116 8 0.746 9±0.061 2 RXRβ 0.546 6±0.016 6 0.639 5±0.018 3 NR1H2(LXRβ) 0.286 1±0.014 5 0.443 5±0.042 5 RARγ 0.184 1±0.021 1 0.840 8±0.021 9 NR2C1 0.178 4±0.026 3 0.296 2±0.015 5 NR2C2 0.176 5±0.000 3 0.191 1±0.013 7 NR1D2 0.171 6±0.008 2 0.969 9±0.097 7 AHR 0.167 9±0.011 7 0.406 6±0.011 9 NR2F6 0.156 1±0.007 5 0.259 6±0.040 6 PPARα 0.085 1±0.025 5 0.216 0±0.012 9 RARα 0.044 7±0.003 5 0.132 6±0.015 5 THRA 0.036 2±0.000 1 0.131 2±0.003 9 RORα 0.026 3±0.001 8 0.000 2±0.000 6 THRβ 0.019 3±0.000 7 0.080 1±0.011 6

2.2 皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中核激素受體mRNA的相對表達(dá)變化 A431細(xì)胞中多數(shù)RXR二聚體家族成員表達(dá)水平較正常角質(zhì)形成細(xì)胞明顯升高，其中以PPARγ、RXRs、RARs變化水平最為顯著。此外，大量孤兒受體在鱗癌A431細(xì)胞中的表達(dá)也顯著升高，包括NR4A1、NR2F1、NR2F2、NR1D2、NR1D1等（見表2）。

表2 A431 中表達(dá)增高的核激素受體基因及其表達(dá)倍數(shù)（與KC相比）

3 討論

核激素受體超家族是目前真核生物體內(nèi)含量最豐富的轉(zhuǎn)錄因子超家族成員的一員，與一系列有效轉(zhuǎn)錄所必需的輔活因子或輔遏阻子發(fā)生相互作用，并與基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄機(jī)制一起，調(diào)節(jié)不同靶基因的啟動(dòng)子、配體或細(xì)胞類型特異性的表達(dá)。核激素受體家族成員參與胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等多種生理過程，并在相關(guān)靶基因的正性及負(fù)性調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。其中糖皮質(zhì)激素、雄激素以及雌激素受體對皮膚的作用最早研究[8-9]，其配體已被大量應(yīng)用于臨床治療。同源序列比對發(fā)現(xiàn)了相關(guān)受體的全部超家族成員，很多成員在維持皮膚平衡方面發(fā)揮了重要作用。其中一組與RXR形成異源二聚體的核激素受體亞群成員，在皮膚生理功能中發(fā)揮尤其關(guān)鍵的作用，其中包括RARs、VDR、LXRs和PPARs等[10-12]。既往研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚主要構(gòu)成細(xì)胞中存在大量核激素受體成員的表達(dá)，提示該家族成員在皮膚發(fā)育中發(fā)揮重要作用[6]。

有關(guān)核激素受體研究的積累已逐漸讓人們認(rèn)識(shí)到，核受體及其調(diào)控的代謝通路的紊亂也可導(dǎo)致糖尿病，腫瘤等許多病理過程。繼Q蛋白耦聯(lián)受體和離子通道之后，核受體已成為第三大類非酶性治療靶點(diǎn)；而基于核激素受體成員與腫瘤發(fā)生關(guān)系的不同認(rèn)識(shí)，腫瘤防治研究工作也逐漸將核受體這一作用靶點(diǎn)重視起來。比如，由雌激素受體α介導(dǎo)的反應(yīng)被證實(shí)是乳腺癌發(fā)病的重要病因。臨床乳腺癌患者中，75%以上腫瘤組織有ERα表達(dá)，這部分腫瘤對抗激素治療敏感，預(yù)后也較好，反之，ERα表達(dá)陰性的乳腺癌患者預(yù)后較差[13]，因此ERα已成為作為臨床區(qū)分病人并采取不同治療措施的重要參考指標(biāo)之一。此外，在上皮細(xì)胞來源的前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，AR在其中起到關(guān)鍵作用，原發(fā)前列腺癌細(xì)胞的增殖需要雄激素的刺激完成，雄激素耗竭療法也因而成為臨床上抑制前列腺癌發(fā)展的標(biāo)準(zhǔn)方案[14]。大量研究表明，多種腫瘤組織或相應(yīng)細(xì)胞中存在著RARs以及RXRs的表達(dá)異常[15-16]。而作為目前已經(jīng)有確定配體的核激素受體家族成員，其配體已被廣泛用于對治療頭頸部、肺等部位癌前病變及降低繼發(fā)性癌的發(fā)生率有很好療效，在皮膚癌、乳腺癌以及宮頸癌等多種惡性腫瘤治療中已進(jìn)入臨床研究階段，我們的研究也發(fā)現(xiàn)在皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中，RXR和RAR的表達(dá)水平均較正常細(xì)胞升高，根據(jù)核激素受體的特性，這也能解釋臨床上廣泛使用的維甲酸藥物治療能明顯抑制腫瘤生長，降低腫瘤的發(fā)病率。但同前所述，維甲酸的副作用在很大程度上限制了其在臨床的廣泛使用，為了研制出更加有效的維甲酸受體藥物，從而得以進(jìn)行更加有效的治療，尤其需要針對與腫瘤相關(guān)的維甲酸受體的轉(zhuǎn)錄、翻譯和磷酸化調(diào)節(jié)的分子機(jī)制開展深入的病理、生理學(xué)研究。隨著對維甲酸作用機(jī)理認(rèn)識(shí)的深入，尋找選擇性更強(qiáng)，毒副作用更小的新型維甲酸配體用于靶向治療，必將在未來的腫瘤治療中發(fā)揮更大的作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中也存在大量核激素受體成員，尤其是RXR異構(gòu)二聚體家族成員的表達(dá)，與正常角質(zhì)形成細(xì)胞相比，多數(shù)RXR異構(gòu)二聚體受體家族成員的mRNA表達(dá)水平升高，其中PPARγ在正常角質(zhì)形成細(xì)胞中表達(dá)水平很低，但在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)明顯升高，這種表達(dá)異常的升高是腫瘤發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)抑或?yàn)槟[瘤治療提供了特異性靶點(diǎn)，尚有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

除上述核激素受體外，皮膚鱗癌A431細(xì)胞中也存在大量孤兒受體的表達(dá)，且部分孤兒受體在A431細(xì)胞中的表達(dá)較正常細(xì)胞明顯升高，比如NR2F2、NR2F1、NR2D2等成員，但由于目前針對這些受體的研究較少，尚不能確定這些受體在皮膚鱗癌發(fā)生及治療中的可能作用。隨著對孤兒受體結(jié)構(gòu)和功能的確定，應(yīng)用高通量篩選和虛擬高通量現(xiàn)代科技手段，以核受體為靶標(biāo)的藥物研究將成為現(xiàn)代藥物研究的一大熱點(diǎn)。