香菇多糖生物合成代謝相關(guān)酶的研究

劉曉翠，田 瑾，周芷苒，王曉敏

（西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川 成都 6 100039）

香菇，一種藥食同源的真菌[1]?，F(xiàn)代研究表明香菇中含有多種活性成分，能提高人體免疫力、防癌抗癌、降血壓及降血脂等[2]。香菇多糖是香菇主要的活性成分之一[3]，其主要成分是葡聚糖，還含有少量的甘露糖、巖藻糖、木糖等[4]。香菇多糖生物活性多樣，對于提高機體免疫力、抗腫瘤、抗感染、抗衰老等都能起到良好的作用[5?6]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，香菇多糖制成的免疫調(diào)節(jié)劑和其他抗腫瘤藥物相比，毒性小、選擇性好、可作用于某一特定免疫環(huán)節(jié)，可開發(fā)成香菇多糖注射液、香菇多糖膠囊用于治療疾病[7]。它作為免疫輔助能與化療藥劑聯(lián)用，來減輕藥物毒性，增加治療效果[8]。

現(xiàn)在關(guān)于微生物多糖合成代謝的研究較少，大多集中于多糖結(jié)構(gòu)、活性藥理及生產(chǎn)等方面。由于香菇屬真菌遺傳物質(zhì)的復(fù)雜性，有關(guān)在酶和基因水平上研究調(diào)控多糖生物合成代謝對多糖含量的影響的相關(guān)研究尚未見報道。有研究[9?10]表明，不同微生物細胞體系中活性多糖的合成代謝基本途徑是相似的。雖然不同多糖在結(jié)構(gòu)上各有差異，但大都是由常見的單糖重復(fù)單元組成，表明真菌多糖的生物合成途徑，特別是前體物合成途徑基本相同[11]。另外有研究[12?14]表明，多糖合成核苷酸糖的最基本的合成途徑為：當(dāng)碳源為葡萄糖時，在葡萄糖激酶的作用下葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸，然后在α-磷酸葡糖變位酶的作用下轉(zhuǎn)化為葡萄糖-1-磷酸，再合成 UDP-葡萄糖、UDP-葡糖醛酸、UDP-半乳糖和dDTP-鼠李糖等，發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源種類不同和產(chǎn)生的多糖組成不同，所涉及的合成關(guān)鍵酶也有所不同，但主要包括葡萄糖激酶、α-磷酸葡糖變位酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-半乳糖-4 差向異構(gòu)酶、磷酸葡糖異構(gòu)酶。目前，關(guān)于控制香菇多糖生物合成代謝相關(guān)酶的研究較少，更未見其關(guān)鍵控制酶的報道。

本文以液體深層發(fā)酵香菇菌絲體，在不同的發(fā)酵條件下綜合分析多糖合成各相關(guān)酶的活性與香菇多糖含量的相關(guān)性，確定胞內(nèi)多糖合成的關(guān)鍵酶，為今后進一步對該關(guān)鍵酶的特性、表達調(diào)控及其與香菇多糖合成的分子機制研究奠定基礎(chǔ)，也將為香菇多糖含量的提高提供生物技術(shù)新途徑，為香菇及其高附加值加工產(chǎn)品的開發(fā)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯20%，葡萄糖2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，VB10.01%，pH自然[15]。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖4%，蛋白胨1%，磷酸二氫鉀0.05%，硫酸鎂0.05%（都是質(zhì)量分數(shù)）。

細胞提取緩沖溶液（20 mmol/L 的磷酸鉀鹽緩沖溶液）：50 mmol/L NaCl、10 mmol/L MgCl2和1 mmol/L 二硫蘇糖醇，pH 6.5[16]。主要試劑見表1，主要設(shè)備見表2。

表1 主要試劑一覽表

表2 主要設(shè)備一覽表

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取及測定

1.2.1.1 菌絲體培養(yǎng)

菌株活化流程參考劉曉翠等[17]的方法，如圖1所示。

圖1 菌種活化流程圖

種子液培養(yǎng)流程參考乜娟娟[18]的方法，如圖2所示。

圖2 種子液培養(yǎng)流程圖

基礎(chǔ)液培養(yǎng)流程如圖3 所示。

圖3 基礎(chǔ)液培養(yǎng)流程圖

1.2.1.2 粗多糖提取

分別取液體深層發(fā)酵所生產(chǎn)的香菇菌絲體粉末等量，放入樣品瓶中，加入20 倍的水，混勻，80℃熱水浴提取2 h。布氏漏斗抽濾，取濾液，濾渣反復(fù)提取2 次，合并濾液，60 ℃減壓濃縮后加4 倍體積的95%乙醇4 ℃沉淀過夜；4 000 r·min?1離心10 min 后，收集沉淀[19]。冷凍干燥，得香菇多糖。

1.2.1.3 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量，濃硫酸與多糖反應(yīng)釋放出單糖，單糖再脫水成糠醛或羥甲基糠醛，糠醛衍生物能與苯酚合成橙黃色化合物，并能使用分光光度計進行測定，此橙黃色化合物在490 nm 處有最大吸收峰[20]。

標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密量取已恒重的無水葡萄糖，配置成1 mg·mL?1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，再分別量取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9 mL 加入試管中，試管中不足1 mL 的補加蒸餾水到1 mL，各試管中分別添加1 mL 6%苯酚溶液，混和均勻后迅速加入5.0 mL 濃硫酸搖勻，靜置10 min，在沸水浴中加熱顯色15 min，取出自然冷卻至室溫，用紫外分光光度計在490 nm 處測定其吸光值，橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量濃度（mg/mL），縱坐標(biāo)為測定出的吸光值（OD 值），繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)回歸處理得出線性回歸方程[21]。

樣品中總糖含量測定：樣品 → 精確稱取 → 配成濃度為0.1 mg·mL?1溶液 → 分光光度計在490 nm 測定樣品吸光度OD 值 → 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其總糖含量。

1.2.2 酶的提取

取發(fā)酵菌液，過濾（或者4 ℃，2 500 r·min?1離心5 min），菌體用預(yù)冷的細胞提取緩沖溶液洗滌過濾2 次，置于預(yù)冷的研缽中，液氮研磨3 次，用1.5 mL 離心管稱取菌體，每100 mg 菌體粉加入1 mL細胞提取液，渦旋震蕩120 s 后，4 ℃，10 000 r·min?1，離心10 min，上清液為細胞提取物，取30 μL 測相關(guān)酶的活性，空白為煮沸的上清液。蛋白濃度采用考馬斯亮藍法測定[22]。

1.2.3 酶活性的檢測

酶活力定義即1 mg 蛋白中的酶在1 min 內(nèi)轉(zhuǎn)化成1 nmol NAD(P)H 為一個單位，故將酶活力單位定為nmol NAD(P)H/(mg protein)/min。而NADP的變化可在340 nm（ε340=6.22 M?1cm?1）波長處測定其吸光度的改變來反映[23]。反應(yīng)溫度為30 ℃，總反應(yīng)體系為 250 μL，酶提取物添加量30 μL。酶活計算公式為：

式中：A1為吸光度起始讀數(shù)；A2為吸光度終讀數(shù)；V1為反應(yīng)液總體積（mL）；V2為加入樣品體積（mL）；m為樣品稀釋倍數(shù)；t為反應(yīng)時間（min）；ρ為樣品蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度（mg/mL）；6.22 為NADPH 摩爾吸光系數(shù)。

具體相關(guān)酶的測定方法如下：

1）葡萄糖激酶（GK）：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液，0.2 mmol/L NADP+，5 mmol/L ATP，5 mmol/L MgCl2，0.2 U 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶。該反應(yīng)通過最后添加酶提取液開始；

2）磷酸葡萄糖變位酶（PGM）：50 mmol/L 三乙醇胺緩沖液（pH 7.2），5 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L NADP+，50 μmol/L 葡萄糖-1,6-二磷酸，4 U 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，1.4 mmol/L D-葡萄糖-1-磷酸二鈉鹽，酶提取液。該反應(yīng)通過最后添加D-葡萄糖-1-磷酸二鈉鹽開始；

3）UDP-磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）：50 mmol/L Tris-HCl（pH 7.8）緩沖液，14 mmol/L MgCl2，0.3 mmol/L NADP+，0.1 mmol/L UDP-葡萄糖，2.1 U 磷酸葡萄糖變位酶，4 U 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，4 mmol/L 無機焦磷酸，酶提取液。該反應(yīng)通過最后添加無機焦磷酸鹽開始；

4）磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（PGI）：50 mmol/L 磷酸鉀緩沖（pH 6.8），5 mmol/L MgCl2，0.4 mmol/L NADP+，4 U 葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，5 mmol/L D-果糖-6-磷酸，酶提取液。該反應(yīng)以添加D-果糖-6-磷酸開始；

5）UDP-葡萄糖脫氫酶（UGD）：100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5）緩沖液，1 mmol/L MgCl2，1 mmol/L NADP+，5 mmol/L UDP-葡萄糖，1 mmol/L二硫蘇糖醇。該反應(yīng)通過最后添加酶提取液開始。

1.2.4 單因素實驗

1）不同碳源種類下酶活性及多糖含量檢測。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別改用蔗糖、淀粉、乳糖和白砂糖代替葡萄糖作為不同的碳源，其他成分及含量保持不變。250 mL 的三角瓶中配置培養(yǎng)基100 mL，滅菌，接種后置于150 r·min?1的恒溫搖床中25 ℃培養(yǎng)5 d。考察不同碳源種類對香菇菌絲體多糖含量及與多糖合成相關(guān)的5 種酶活性的影響。

2）不同氮源種類下酶活性及多糖含量檢測。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別改用酵母浸粉、尿素、牛肉膏和NaNO3代替蛋白胨作為不同的氮源，其他成分及含量保持不變。250 mL 的三角瓶中配置培養(yǎng)基100 mL，滅菌，接種后置于150 r·min?1的恒溫搖床中25 ℃培養(yǎng)5 d?？疾觳煌捶N類對香菇菌絲體多糖含量及與多糖合成相關(guān)的5 種酶活性的影響。

3）不同pH 值下酶活性及多糖含量檢測。在5 個250 mL 三角瓶中各配置100 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用pH 計和1%氫氧化鈉溶液將各培養(yǎng)基的pH 值分別調(diào)節(jié)為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，其他成分及含量保持不變。滅菌，接種后置于150 r·min?1的恒溫搖床中25 ℃培養(yǎng)5 d?？疾觳煌跏紁H 值對香菇菌絲體多糖含量及與多糖合成相關(guān)的5 種酶活性的影響。

4）不同溫度下酶活性及多糖含量檢測。在5 個250 mL 三角瓶中各配置100 mL 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，置于18、20、22、25、28 ℃下培養(yǎng)。滅菌，接種后置于150 r·min?1的恒溫搖床中發(fā)酵5 d，測定香菇菌絲體多糖含量及多糖合成相關(guān)的5 種酶活性與不同培養(yǎng)溫度的影響。

1.2.5 正交實驗

在單因素實驗的基礎(chǔ)上進行正交實驗，以確定香菇多糖量與多糖合成相關(guān)5 種酶活性的影響。正交實驗因素與水平見表3。

表3 正交實驗因素與水平

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用正交設(shè)計助手對正交試驗進行設(shè)計，利用Excel 軟件對數(shù)據(jù)進行計算整理，SPSS 軟件對結(jié)果進行顯著性的分析，Origin 軟件繪圖，“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示試驗結(jié)果數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果及分析

2.1.1 不同碳源培養(yǎng)條件下相關(guān)酶的活性及多糖含量結(jié)果分析

由圖4 可知，以葡萄糖為碳源時，香菇多糖含量最多。且實驗觀察發(fā)現(xiàn)以葡萄糖為碳源時，香菇菌絲體生長量最多，菌絲濃密，顏色呈乳白色，菌絲質(zhì)量相較于其他4 種碳源的培養(yǎng)基更好，這可能是葡萄糖比其他4 種碳源更易被香菇菌絲體吸收利用，更適合生長繁殖，其次是可溶性淀粉和蔗糖作為碳源時，香菇多糖含量和香菇菌絲體生長量較多。王瓊[24]在研究中發(fā)現(xiàn)使用高濃度葡萄糖（大于20 g/L）能促進靈芝M 型球菌的形成，并且多糖的產(chǎn)量達到2 g/L。

圖4 不同碳源條件下生成多糖的質(zhì)量濃度

由圖5 發(fā)現(xiàn)，顯示5 種酶在不同碳源發(fā)酵條件下的活性差異顯著，總的來說，GK 的相對活性最高，與其他4 種酶活性相差極顯著，PGM 活性次之，UGP、PGM 和 PGI 的活性較低。結(jié)合兩圖發(fā)現(xiàn)，GK 活性越高，其余4 種酶活性越低，GK 活性與其他4 種酶活性相差越大，多糖含量越高。依據(jù)香菇多糖含量以及菌絲體生長量的多少，選擇葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖這3 原料作為正交實驗驗碳源的3 個水平。

圖5 不同碳源條件下5 種酶的酶活力

2.1.2 不同氮源培養(yǎng)條件下相關(guān)酶的活性及多糖含量結(jié)果分析

實驗過程中，添加無機氮源尿素和NaNO3代替蛋白胨發(fā)現(xiàn)香菇菌絲體不能生長，說明無機氮源不能被香菇菌絲體利用，不能作為其氮源的來源。

由表4 可知，以牛肉膏為氮源時，香菇多糖含量最多。且實驗觀察發(fā)現(xiàn)以牛肉膏為氮源時，香菇菌絲體生長量最多，菌絲濃密，顏色呈淡黃色，菌絲質(zhì)量相較于其他氮源的培養(yǎng)基更好。以蛋白胨作為氮源時，香菇多糖含量和香菇菌絲體生長量較多。以酵母浸粉為氮源時，香菇多糖含量和香菇菌絲體生長量最少。

表4 不同氮源條件下生成多糖的質(zhì)量濃度

由圖6 可知，顯示5 種酶在不同氮源發(fā)酵條件下的活性差異顯著，總的來說，GK 的相對活性最高，與其他4 種酶活性相差極顯著，PGM 次之，UGP、PGM 和 PGI 活性較低，5 種酶的活性大致隨多糖含量的增加而升高。結(jié)合圖表發(fā)現(xiàn)，GK 活性越高，GK 活性與其他4 種酶活性相差越大，多糖含量越高。冀英萍[25]研究發(fā)現(xiàn)蛹蟲草菌多糖的最佳氮源發(fā)酵條件是4%的牛肉膏，其蛹蟲草菌多糖含量和PGM 的總活力都有提高。

圖6 不同氮源條件下5 種酶的酶活力

2.1.3 不同初始pH 值培養(yǎng)條件下相關(guān)酶的活性及多糖質(zhì)量濃度結(jié)果分析

由圖7 可知，pH 為5 和5.5 時，多糖質(zhì)量濃度相差不大；當(dāng)pH 為6 時，多糖質(zhì)量濃度最低；當(dāng)pH 為6.5 時，GK 相對活性比pH 為6 時的GK 活性高，香菇多糖質(zhì)量濃度也比pH 為6 時高；當(dāng)pH 為7 時，多糖質(zhì)量濃度最高。王杰等[26]發(fā)現(xiàn)pH 在5.0～7.0 范圍內(nèi)，香菇菌絲體生物量和胞多糖質(zhì)量濃度隨著pH 值的升高而增加。

圖7 不同pH 條件下生成的多糖質(zhì)量濃度

由圖8 發(fā)現(xiàn)，顯示5 種酶在不同pH 發(fā)酵條件下的活性差異顯著，總的來說，GK 的相對活性最高，與其他4 種酶活性相差極顯著，PGM 活性次之，UGP、PGM 和 PGI 活性較低。結(jié)合兩圖發(fā)現(xiàn)，GK 活性越高，GK 活性與其他4 種酶活性相差越大，多糖質(zhì)量濃度越高。當(dāng)pH 為6.5 時，GK 相對活性比pH 為6 時的GK 活性高，香菇多糖質(zhì)量濃度也比pH 為6 時高，但pH 為6 時的其他酶（PGM，UGP，PGI，UGD）相對活性比要比其余的pH 都要高。Lin 等[27]研究發(fā)現(xiàn)靈芝胞外多糖合成酶（PGM，PGI）在pH 值為6 時能保持較高的水平。

圖8 不同pH 條件下5 種酶的酶活力

2.1.4 不同溫度培養(yǎng)條件下相關(guān)酶的活性及多糖含量結(jié)果分析

由圖9 發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度為18、20、22 ℃時，多糖質(zhì)量濃度呈增大趨勢，但變化不大，香菇菌絲體生長量較多；當(dāng)溫度為25 ℃時，多糖質(zhì)量濃度最高，香菇菌絲體生長量最多；溫度為28 ℃時，多糖質(zhì)量濃度最低，香菇菌絲體含量最少。

圖9 不同溫度條件下生成的多糖質(zhì)量濃度

由圖10 發(fā)現(xiàn)，5 種酶在不同溫度發(fā)酵條件下的活性差異顯著，總的來說，GK 的相對活性最高，與其他4 種酶活性相差極顯著，PGM 活性次之，UGP、PGM 和 PGI 活性較低，5 種酶活性大致隨多糖質(zhì)量濃度增加而升高。結(jié)合2 圖發(fā)現(xiàn)，GK 活性越高，GK 活性與其他4 種酶活性相差越大，多糖質(zhì)量濃度越高。喬蓮逵[28]研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，靈芝胞外多糖各相關(guān)合成酶的比酶活呈先增大后減小的趨勢。

圖10 不同溫度條件下5 種酶的酶活力

2.2 正交實驗數(shù)據(jù)分析

由表5 可知，4 個因素中對多糖含量具有顯著影響的是碳源種類，因此在香菇菌絲體培養(yǎng)過程中要選取最佳碳源以提高多糖含量。根據(jù)表6 的直觀分析，可以得出以多糖含量為指標(biāo)時，影響香菇多糖含量的主次因素為A(碳源種類)>B（氮源種類）>D（溫度）>C（pH），在最佳條件下進行驗證實驗，測得香菇多糖含量為0.1147 mg/mL，高于正交實驗中的最大值。

表5 正交實驗分析表

表6 方差分析

3 結(jié)論

通過單因素實驗，優(yōu)化了碳源、氮源、pH、溫度4 個條件，比較在不同發(fā)酵條件下得到的香菇多糖的質(zhì)量濃度，最終得到的最佳液體發(fā)酵條件是最適發(fā)酵時間為5 d，最適碳源和氮源為40 g·L?1葡萄糖，10 g·L?1牛肉膏，最適pH 和培養(yǎng)溫度為7 和25 ℃。同時分析了香菇多糖和合成相關(guān)的酶的活性之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在不同發(fā)酵條件下培養(yǎng)香菇菌絲體的胞內(nèi)葡萄糖激酶（GK）、磷酸葡萄糖變位酶（PGM）、UDP 葡萄糖焦磷酸化酶（UGP）和磷酸葡萄糖異構(gòu)酶（PGI）活性隨著多糖含量的增加而升高，表明這5 種酶與香菇多糖的生物合成有關(guān)，其中GK 活性最高，PGM 活性次之，這2 種酶與香菇多糖的生物合成相關(guān)性最大，說明GK 和PGM 是控制香菇菌絲體多糖合成的關(guān)鍵酶。