長(zhǎng)春新堿調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞Hep3B增殖遷移侵襲及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究*

刁云輝 劉 琳 沙金平 薛 萌

1.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院消化內(nèi)科 (河南 南陽(yáng)，473000) 2.河南省南陽(yáng)市中心醫(yī)院心內(nèi)一科

肝癌是常見的惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和死亡率，嚴(yán)重威脅人類生命健康[1]。長(zhǎng)春新堿主要是從長(zhǎng)春花葉中提取的二聚吲哚類化合物，具有良好的抗腫瘤作用。長(zhǎng)春新堿通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞微管蛋白而干擾腫瘤細(xì)胞代謝，在臨床中主要用于治療急性淋巴細(xì)胞白血病、何金杰及非何金杰淋巴瘤[2]。磷脂酞肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡等生命過(guò)程，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用[3，4]。研究顯示，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲[5]。目前，長(zhǎng)春新堿能否通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌作用還未知。因此，本研究以肝癌Hep3B細(xì)胞為研究對(duì)象，旨在探究長(zhǎng)春新堿對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響及是否通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 肝癌細(xì)胞系Hep3B購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清(FBS)購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(IGF-1)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人Ki-67、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、MMP9、磷酸化磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)和β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體購(gòu)自北京中杉金橋生物試劑公司，Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hep3B細(xì)胞用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱環(huán)境為溫度37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%。當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶溶液消化，以1∶2～1∶3比例傳代培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞分組處理 Hep3B細(xì)胞分為對(duì)照組(NC組)、不同濃度(0.02、0.04、0.08 μmol/L)[6]長(zhǎng)春新堿組、長(zhǎng)春新堿+IGF-1組。對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基正常培養(yǎng)24 h；不同濃度長(zhǎng)春新堿組細(xì)胞分別用含終濃度為0.02、0.04、0.08 μmol/L長(zhǎng)春新堿的培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h；長(zhǎng)春新堿+IGF-1組細(xì)胞用含終濃度為0.04 μmol/L長(zhǎng)春新堿和100 ng/ml IGF-1[7]的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)24 h。

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖 調(diào)整Hep3B細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/ml，每孔200 μl接種于96孔板中。按照上述分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，加入10 μl CCK-8試劑，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處光密度(OD)值。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 調(diào)整Hep3B細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/ml，每孔1.0 ml接種于24孔板中。按照上述分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書，加入10 μl Annexin V-FITC，避光孵育10 min。加入5 μl PI，避光孵育10 min后，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 調(diào)整Hep3B細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml。遷移實(shí)驗(yàn)：取Transwell上室加入100 μl細(xì)胞懸液，下室加入500 μl含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。按照上述分組處理，培養(yǎng)結(jié)束后，吸棄培養(yǎng)基。取出小室，以4%多聚甲醛固定30 min，0.4%結(jié)晶紫染色15 min，倒置顯微鏡觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：Transwell上室鋪Matrigel基質(zhì)膠，自然晾干后加入100 μl細(xì)胞懸液，后續(xù)操作同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 Western Blot法檢測(cè)細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá) RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白含量后進(jìn)行定量，然后行10% SDS-PAGE電泳。電泳后，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，5 %脫脂奶粉封閉2 h。分別加入Ki-67(1∶800)、Cleaved-caspase-3(1∶1 000)、MMP2(1∶800)、MMP9(1∶800)、p-PI3K(1∶1 000)、p-Akt(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)一抗，4℃孵育過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶5 000)，37℃孵育1 h。加入化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度長(zhǎng)春新堿對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖的影響 與NC組比較，不同濃度長(zhǎng)春新堿作用Hep3B細(xì)胞后，細(xì)胞OD 450 nm值和Ki-67蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western Blot檢測(cè)不同濃度長(zhǎng)春新堿對(duì)Hep3B細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)的影響

表1 不同組別對(duì)Hep3B細(xì)胞OD450nm值和Ki-67蛋白表達(dá)的影響

2.2 長(zhǎng)春新堿對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較，不同濃度長(zhǎng)春新堿作用Hep3B細(xì)胞后，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖2、表2。

圖2 長(zhǎng)春新堿對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)影響圖 (A.流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B.Western Blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá))

表2 不同組別對(duì)Hep3B細(xì)胞凋亡的影響

2.3 長(zhǎng)春新堿對(duì)Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲的影響 與NC組比較，0.04 μmol/L長(zhǎng)春新堿作用Hep3B細(xì)胞后，細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見圖3、表3。

圖3 長(zhǎng)春新堿對(duì)Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲的影響圖 (A.Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移侵襲；B.Western Blot檢測(cè)MMP2和MMP9蛋白表達(dá))

表3 不同處理方法組別對(duì)Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲的影響

2.4 長(zhǎng)春新堿對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與NC組比較，0.04 μmol/L長(zhǎng)春新堿作用Hep3B細(xì)胞后，細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，見表4、圖4。

圖4 Western Blot檢測(cè)p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)

表4 不同處理方法組別對(duì)JAK/STAT3信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 IGF-1可以逆轉(zhuǎn)長(zhǎng)春新堿對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響 與0.08 μmol/L長(zhǎng)春新堿組比較，長(zhǎng)春新堿+ IGF-1組長(zhǎng)春新堿作用Hep3B細(xì)胞后，細(xì)胞OD 450 nm值、遷移和侵襲數(shù)及Ki-67、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，細(xì)胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)降低(P<0.05)，p-PI3K和p-Akt蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，見圖5、表5。

表5 不同處理方法組別對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖、遷移侵襲和凋亡的影響

圖5 Western Blot檢測(cè)Hep3B細(xì)胞Ki-67、Cleaved-caspase-3、MMP2、MMP9、p-PI3K、p-Akt蛋白的表達(dá)圖

3 討論

長(zhǎng)春新堿是從夾竹桃科植物長(zhǎng)春花中提取出的生物堿，已被臨床用于治療白血病，且具有較好的治療效果，另外其對(duì)淋巴瘤、乳腺癌等腫瘤也具有一定的治療療效。長(zhǎng)春新堿的抗腫瘤靶點(diǎn)是微管蛋白，其主要抑制微管蛋白的聚合影響紡錘體的形成，抑制有絲分裂過(guò)程。此外，長(zhǎng)春新堿還可抑制癌細(xì)胞內(nèi)RNA酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)DNA、嘌呤等物質(zhì)無(wú)法正常合成，蛋白質(zhì)代謝紊亂，細(xì)胞膜受損等，最終使腫瘤細(xì)胞凋亡。

細(xì)胞增殖紊亂和凋亡受阻是腫瘤發(fā)生的重要機(jī)制之一，抑制腫瘤細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的重要途徑[8]。Ki-67參與細(xì)胞有絲分裂過(guò)程，是細(xì)胞增殖的標(biāo)志性蛋白，可反映細(xì)胞增殖活性[9]。caspase-3是caspase家族的重要成員，其活化后進(jìn)一步切割下游分子，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡[10]。本研究顯示，長(zhǎng)春新堿可劑量依賴性降低Hep3B細(xì)胞OD值及Ki-67蛋白表達(dá)，而促進(jìn)Hep3B細(xì)胞凋亡及Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)，與相關(guān)研究報(bào)道[11]結(jié)果一致，表明長(zhǎng)春新堿可抑制Hep3B細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗肝癌作用。腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的主要原因[12]，抑制腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲對(duì)于降低腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移具有重要意義。本研究顯示，0.08 μmol/L長(zhǎng)春新堿可劑量依賴性降低Hep3B細(xì)胞的遷移和侵襲數(shù)及細(xì)胞中MMP2和MMP9蛋白表達(dá)，與相關(guān)報(bào)道結(jié)果一致[13]，表明長(zhǎng)春新堿可抑制Hep3B細(xì)胞遷移和侵襲。

PI3K/Akt信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和代謝等過(guò)程，與人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[14]。研究顯示，STYXL1可通過(guò)激活PI3K/Akt途徑下調(diào)CELF2來(lái)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡[15]。miR-616在肝癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)升高，敲低miR-616通過(guò)抑制PI3K/AKT途徑減弱肝癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[16]。本研究顯示，0.08 μmol/L長(zhǎng)春新堿可抑制Hep3B細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt蛋白的表達(dá)，提示長(zhǎng)春新堿可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路的激活發(fā)揮抗肝癌作用。IGF-1是一種促生長(zhǎng)肽類激素，可激活PI3K/Akt信號(hào)通路[17]。研究顯示，IGF-1可通過(guò)促進(jìn)早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1(EGR1)表達(dá)增強(qiáng)肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[7]。本研究顯示，IGF-1與長(zhǎng)春新堿共同作用Hep3B細(xì)胞后，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力升高，而凋亡程度降低，表明IGF-1逆轉(zhuǎn)了長(zhǎng)春新堿對(duì)Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用，進(jìn)一步說(shuō)明長(zhǎng)春新堿通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮抗肝癌作用。

綜上所述，長(zhǎng)春新堿可抑制肝癌Hep3B細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗肝癌作用，其作用機(jī)制與抑制細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的激活有關(guān)。