2個葡萄品種越冬抗寒性比較及其生理響應分析*

趙 瀅，楊義明，張寶香，李昌禹，王衍莉，路文鵬

（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林長春 130112）

低溫在很大程度上決定了不同葡萄種類和品種的分布范圍與生產(chǎn)性能[1-2]。山葡萄作為東北地區(qū)的釀酒葡萄，能夠在-30 ℃的嚴寒條件下露地安全越冬，而葡萄砧木品種‘貝達’枝條則需埋土防寒越冬[3-4]，可見不同葡萄品種越冬抗寒能力存在差異。

有研究表明，木本植物抗寒性可通過連續(xù)的低溫鍛煉過程形成，是一個動態(tài)、復雜的生理響應過程[5-6]。在低溫鍛煉過程中植物會誘導一系列信號傳導反應，并通過內(nèi)源激素、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、次生代謝物質(zhì)等生理生化變化來適應低溫環(huán)境[7-10]。多數(shù)葡萄品種在氣溫低于-15～-10 ℃時枝條即需埋土防寒，導致葡萄植株自然越冬過程中相關抗寒機制研究進展緩慢，所以山葡萄也就成為低溫鍛煉過程中研究越冬抗寒力形成的有力材料。而目前有關研究多集中于對葡萄屬某些種質(zhì)或品種開展的實驗室抗寒性鑒定與比較[11-12]，或者僅測定某一時期低溫處理下的抗寒指標[13]，不能夠完全真實地反映其在田間的實際抗寒能力，相關抗寒機制仍不明晰。

本研究以山葡萄品種‘左山一’和葡萄砧木品種‘貝達’葉片和當年生枝條為試材，比較其露地自然越冬后枝條萌芽率來反映其越冬實際抗寒能力，同時測定在田間自然低溫條件下葉片和枝條中內(nèi)源激素含量、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、總酚含量及多酚氧化酶活性，在葉片與枝條之間信號及物質(zhì)轉(zhuǎn)化基礎上，深入比較分析兩者抗寒性差異的生理基礎，對抗寒葡萄品種選育及區(qū)域性栽培具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與抗寒性鑒定

試驗于2018年8月至2019 年1月在中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所國家果樹種質(zhì)山葡萄圃（左家）中進行。該圃位于北緯44°04′，東經(jīng)126°05′，海拔190 m，年平均氣溫3.6 ℃，絕對低溫-39.8℃。圃內(nèi)設有HOBO小型氣象監(jiān)測系統(tǒng)，可監(jiān)測并自動記錄資源圃內(nèi)的氣象數(shù)據(jù)。

本試驗材料為山葡萄品種‘左山一’（Vitis amurensis‘Zuoshanyi’）和葡萄砧木品種‘貝達’（V.riparia×V.labrusca‘Beta’）葉片及當年生枝條。葉片在休眠落葉前進行3 次取樣，分別為2018年8月23日、9 月26日和10 月8日；枝條進行6次取樣，分別為2018年8月23日、9 月26日、10月8日、11月9日、12 月20日和2019年1月11日，其中‘貝達’的枝條均為冬季存活枝條。每次取樣后立即放入液氮壺中速凍，然后帶回實驗室-80℃超低溫冰箱中保存，以用于生理指標的測定。

抗寒性鑒定采用田間鑒定法，通過調(diào)查自然越冬后2 個葡萄品種枝條的萌芽率來進行鑒定。田間萌芽率調(diào)查參照劉崇懷等[14]的方法，2019年5月初調(diào)查2 個品種枝條在資源圃中經(jīng)自然越冬后的萌芽情況，統(tǒng)計萌芽率。

1.2 測定項目與方法

脫落酸（ABA）提取參照Dobrev和Kamínek[15]的方法。稱取0.5 g 樣品，加入5 mL 內(nèi)含1 mmol/L二叔丁基對甲苯酚（BHT）和1%PVPP預冷的80%甲醇溶液，弱光下冰浴研磨勻漿，4℃下過夜提取，然后4℃下12 000×g轉(zhuǎn)速離心15 min獲取上清液，并記錄體積。上清液經(jīng)氮氣吹干，加入50%甲醇洗滌后過C18膠柱，再用氮氣吹干殘余甲醇，得到純化的ABA；再加入0.5 mL 內(nèi)含0.1%吐溫-20和0.1%白明膠的0.01 mmol/L 磷酸緩沖液（pH值7.5）定容。ABA含量測定采用中國農(nóng)業(yè)大學研發(fā)的酶聯(lián)免疫試劑盒。

葉片和枝條中可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法[16]；淀粉含量采用愛爾蘭Megazyme 公司生產(chǎn)的K-TSTA試劑盒進行測定；脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法[17]；總酚含量測定采用福林酚比色法[18]；多酚氧化酶（PPO）活性測定采用紫外分光光度法，測定波長420 nm 下吸光值的變化[19]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SAS 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和差異顯著性檢驗（LSD法，P＜0.05）。作圖采用SigmaPlot 10.0 軟件，每個樣品3次生物學重復。

2 結(jié)果與分析

2.1 自然越冬后2個葡萄品種抗寒性鑒定

2018年8月至2019年1月整個取樣期間的氣溫逐漸降低，2018年8月上旬的最低氣溫在14～21℃范圍內(nèi)，9月中旬時最低氣溫已降至10℃，9月25日第1次早霜過后最低氣溫降至0℃，10月上中旬的最低氣溫已降至0℃以下，到2019年1月中旬的最低氣溫為-20 ℃左右，1月25日的最低氣溫達到-32℃（圖1-A）。

而2 個葡萄品種經(jīng)自然越冬后，‘左山一’枝條的田間萌芽率為80.81%，顯著高于‘貝達’的30.12%（圖1-B）。說明‘左山一’的抗寒性明顯強于‘貝達’。同時，低溫馴化初期，‘左山一’葉片變紅時，‘貝達’葉片仍為綠色；前者葉片脫落時間也早于后者。

圖1 2018年8月至2019年1月資源圃氣溫變化及2個葡萄品種抗寒性田間鑒定

2.2 自然低溫下2個葡萄品種ABA 含量的變化

從8月23日的第1次取樣到早霜過后9月26日的第2 次取樣，‘左山一’葉片中的ABA含量大幅度升高，到10 月8日的第3次取樣，‘左山一’葉片中的ABA含量已迅速下降。但整個取樣期間，‘貝達’葉片中的ABA含量始終呈上升趨勢，到10月上旬‘貝達’葉片中的ABA含量已顯著高于‘左山一’（圖2-A）。

2 個品種枝條中的ABA 含量變化基本表現(xiàn)出相反的趨勢，且二者之間的差異始終達顯著水平，10月后‘貝達’枝條中的ABA 含量一直顯著高于‘左山一’（圖2-B）。

圖2 自然低溫下2個葡萄品種葉片（A）和枝條（B）中ABA 含量的變化

2.3 自然低溫下2個葡萄品種滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的變化

8月下旬‘左山一’和‘貝達’葉片中可溶性糖含量接近；9月底時隨著氣溫的下降，‘左山一’葉片中可溶性糖含量迅速上升，且顯著高于‘貝達’；10月上旬葉片脫落前，‘左山一’可溶性糖含量大幅度下降，但仍顯著高于‘貝達’（圖3-A）。2個品種枝條中的可溶性糖含量則隨氣溫降低基本呈上升趨勢，并且從10 月開始‘左山一’枝條中的可溶性糖含量始終顯著高于‘貝達’（圖3-B）。

整個取樣期間，2個葡萄品種葉片和枝條中的淀粉含量均呈下降趨勢。除10月‘貝達’葉片中的淀粉含量略高于‘左山一’外，其余2 次取樣均是‘左山一’高于‘貝達’，且在9月底時二者差異達顯著水平（圖3-C）。而‘左山一’枝條中的淀粉含量僅在8—10月顯著高于‘貝達’，其含量下降幅度也明顯大于‘貝達’（圖3-D）。

2 個葡萄品種葉片和枝條中的脯氨酸含量隨氣溫降低基本呈上升趨勢。從9月底低溫馴化開始，‘貝達’葉片中的脯氨酸含量高于‘左山一’，10月上旬含量差異達顯著水平（圖3-E）。低溫馴化前期，2 個品種枝條中的脯氨酸含量差異不明顯，從11月開始‘貝達’枝條中的脯氨酸含量顯著高于‘左山一’（圖3-F）。

圖3 自然低溫下2個葡萄品種葉片（A、C、E）和枝條（B、D、F）中可溶性糖、淀粉和脯氨酸含量的變化

2.4 自然低溫下2 個葡萄品種總酚含量和PPO 活性的變化

在整個取樣期間，‘左山一’葉片中的總酚含量先迅速上升而后略有下降，‘貝達’則基本呈平穩(wěn)上升趨勢，且‘左山一’的總酚含量始終顯著高于‘貝達’（圖4-A）。而‘左山一’枝條中的總酚含量除8月顯著低于‘貝達’外，其余取樣時間基本顯著高于‘貝達’（圖4-B）。

在整個取樣期間，‘貝達’葉片和枝條中的PPO活性始終顯著高于‘左山一’?！愡_’葉片中的PPO活性呈先上升后下降的趨勢，‘左山一’表現(xiàn)為逐漸上升的趨勢（圖4-C）?！愡_’枝條中的PPO活性也是先升高后大幅下降，‘左山一’枝條中的PPO 活性從10月開始逐漸下降（圖4-D）。

圖4 自然低溫下2個葡萄品種葉片（A、C）和枝條（B、D）中總酚含量和PPO活性的變化

3 討論與結(jié)論

本研究對露地自然越冬、未埋土防寒的2個葡萄品種枝條萌芽率調(diào)查結(jié)果表明，‘左山一’枝條田間萌芽率為80.81%，顯著高于‘貝達’的30.12%，說明2 個葡萄品種抗寒性差異明顯。這與我們前期采用TTC染色圖像可視化評估法鑒定了葡萄種質(zhì)抗寒性的研究結(jié)果相一致，‘左山一’枝條低溫半致死溫度（LT50）為-38.53℃，‘貝達’LT50為-28.53℃[20]。

有研究表明，ABA作為逆境響應的信號分子，在低溫下促進葉片脫落的同時也啟動了促休眠調(diào)控機制以適應自然低溫[21-23]。本研究2個品種間比較發(fā)現(xiàn)，抗寒性強的品種‘左山一’葉片ABA含量在9月26日早霜過后大幅升高，10 月上旬其葉片變紅脫落前急劇下降，而此時‘貝達’葉片仍為綠色；并且‘左山一’葉片和枝條中的ABA含量達到峰值時間均明顯早于抗寒性弱的品種‘貝達’。而ABA含量的升高能夠促進和調(diào)節(jié)蔗糖在植物體內(nèi)的運輸[24-25]。由此推測，‘左山一’葉片在脫落前可溶性糖大幅積累和外運可能與ABA含量升高有關，隨之其枝條中可溶性糖含量升高明顯?？扇苄蕴亲鳛闈B透調(diào)節(jié)物質(zhì)可增強植物抗寒性[26-27]，本研究中抗寒性強的山葡萄品種‘左山一’葉片和枝條中的可溶性糖含量始終高于抗寒性弱的葡萄砧木品種‘貝達’。

除可溶性糖外，木本植物抗寒性提高也與淀粉水解含量下降密切相關[28]，本研究結(jié)果也支持了這一結(jié)論。2個葡萄品種葉片和枝條中淀粉含量隨氣溫降低下降明顯，特別是越冬期間‘左山一’枝條淀粉含量急速下降。貯藏淀粉水解其含量下降后可轉(zhuǎn)化為可溶性糖，以幫助植物抵御冬季嚴寒[27-28]。但對于抗寒性弱的‘貝達’而言，其葉片在脫落前脯氨酸含量大幅上升，同時其枝條中脯氨酸含量在越冬過程中顯著高于抗寒性強的‘左山一’，推測‘貝達’可能更多地利用脯氨酸作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來抵御自然低溫，這在火龍果[29]、落葉松[9]、薔薇[30]等研究中得到證實。可見，2 個葡萄品種在越冬過程中抵御冷凍低溫的滲透調(diào)節(jié)機制上存在明顯的種間差異。

另外，低溫脅迫會誘導植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的產(chǎn)生[31-32]。相比于‘貝達’，抗寒性強的品種‘左山一’葉片和枝條中的總酚含量在低溫馴化初期大幅升高，此時較高的總酚含量有利于有機物質(zhì)積累[33]。隨著冬季嚴寒的到來，11 月時‘左山一’枝條中的總酚含量又一次明顯升高，而此時較高的總酚含量有利于清除低溫誘導產(chǎn)生的活性氧，從而減輕活性氧造成的低溫傷害，保護其枝條在露地條件下安全越冬[34]。此外，2 個品種多酚氧化酶（PPO）活性也存在明顯的種間差異。與總酚含量不同，‘左山一’葉片和枝條中的PPO 活性始終低于‘貝達’。正常細胞中PPO與膜結(jié)合呈潛伏狀態(tài)，當受到逆境脅迫后，膜結(jié)構(gòu)瓦解，PPO被激活，與酚類物質(zhì)接觸，催化醌類物質(zhì)形成[35]。所以抗寒性弱的品種‘貝達’較高的PPO活性可能與其受到的低溫傷害活性被激活有關。除氧化作用外，有學者認為PPO還具有抗氧化保護作用，這在橄欖樹低溫脅迫響應機制研究中得到證明[36]。所以一方面由于‘貝達’受到的低溫傷害使其PPO 活性顯著高于‘左山一’，另一方面‘貝達’也可能利用PPO作為保護酶來抵御自然低溫。

綜上所述，ABA作為逆境響應信號分子，調(diào)控了抗寒性強的山葡萄品種‘左山一’葉片和枝條中可溶性糖的積累與運輸，并以淀粉形式貯藏；隨著冬季嚴寒的到來，淀粉發(fā)生水解轉(zhuǎn)化為可溶性糖，提高了‘左山一’應對低溫的滲透調(diào)節(jié)能力；而枝條中總酚含量的升高有利于有機物積累的同時又可清除低溫誘發(fā)產(chǎn)生的活性氧，進一步增強了抗寒性強的山葡萄品種‘左山一’植株在露地條件下抵御冬季嚴寒的能力。而葡萄砧木品種‘貝達’雖然在低溫馴化后其葉片和枝條中的脯氨酸含量開始顯著高于‘左山一’，同時PPO活性也始終處于較高水平，但仍不足以支撐其枝條的露地安全越冬，所以‘貝達’露地自然越冬后其枝條發(fā)生大量死亡。