實時熒光跨越式滾環(huán)等溫擴增技術(shù)檢測食品中的志賀氏菌

王立娟，郭威，張先舟，馬曉燕，張偉，2，3*

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理工學(xué)院，河北 滄州 061100）

食源性疾病是全世界關(guān)心的重要公共衛(wèi)生問題，志賀氏菌病占其中很大一部分[1]，它是由志賀氏菌引發(fā)的一種急性腸胃疾病[2]，臨床特征包括發(fā)燒、腹部疼痛、中度到重度水樣腹瀉[3]。一旦治療不及時，可能會導(dǎo)致腸道炎、脫水甚至死亡，嚴(yán)重危害身體健康，特別是兒童和免疫缺陷人群[4]。志賀氏菌主要存在于手工加工的蔬菜沙拉、鮮奶制品或煮熟后的肉制食品中[5]，常引起食物中毒。因此，志賀氏菌的檢測在食品安全領(lǐng)域具有重要意義[6]，建立一種新的快速、靈敏、特異性高的檢測方法，對于及時檢出食品中的志賀氏菌至關(guān)重要。

志賀氏菌的檢測方法大致分為三大類，即傳統(tǒng)培養(yǎng)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法[7]。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法以GB 4789.5—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物檢驗志賀氏菌檢驗》方法為主[8]，該方法是鑒定志賀氏菌的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)，檢測準(zhǔn)確度高且穩(wěn)定。但是傳統(tǒng)方法檢測志賀氏菌操作繁瑣，耗時費力且每次處理的樣品數(shù)量很少，不能滿足快速檢測的需求。免疫學(xué)方法以酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（enzyme-linked immunosorbent assays，ELISA）[9]、膠體金免疫層析技術(shù)（immune colloidal gold technique，GICT）[10]較為常見。免疫學(xué)方法雖然大大縮短了檢測時長[11]，但靈敏度較低[12]。分子檢測技術(shù)主要包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[13]、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法（loop mediated isothermal amplification，LAMP）[14]、滾環(huán)擴增技術(shù)（rolling circle amplification，RCA）[15]等。PCR 和實時熒光定量PCR檢測技術(shù)與傳統(tǒng)方法和免疫學(xué)方法相比，雖然有許多優(yōu)點，但是其相對于等溫擴增技術(shù)LAMP、RCA等擴增效率和靈敏度較低。LAMP和RCA技術(shù)可高效擴增DNA，但是LAMP需要4條～6條引物，這些引物的設(shè)計和反應(yīng)體系復(fù)雜，引物之間易相互作用，產(chǎn)生非特異性結(jié)果，且無法通過對擴增產(chǎn)物測序，判斷擴增結(jié)果的正確性。RCA技術(shù)擴增線性DNA則需要鎖式探針和連接酶[16]，且需要探針環(huán)化，操作過程復(fù)雜，耗時長約4 h。

近年來，跨越式滾環(huán)等溫擴增（saltatoryrollingcircle amplification，SRCA）技術(shù)被用于多種病原菌檢測[17-20]，該方法克服了等溫擴增技術(shù)的缺點，僅需要2條引物，在Bst DNA聚合酶的作用下，不需人為環(huán)化，即可實現(xiàn)線性DNA的擴增[21]。本研究以期在SRCA方法的基礎(chǔ)上，根據(jù)志賀氏菌特異性基因ipaH設(shè)計篩選引物，建立一種高效、靈敏的實時熒光跨越式滾環(huán)等溫擴增（real-time fluorescence saltatory rolling circle amplification，RF-SRCA）方法對志賀氏菌進行檢測，以有效檢出病原菌，保障食品安全和消費者健康。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌株

本研究采用32株菌進行RF-SRCA方法特異性檢測，其中志賀氏菌13株，非志賀氏菌19株。菌株名稱及其來源如表1所示。

表1 試驗菌株Table 1 The strains list in this study

續(xù)表1 試驗菌株Continue table 1 The strains list in this study

1.1.2 樣品與試劑

試驗所用60種食品樣品：當(dāng)?shù)馗鞒泻娃r(nóng)貿(mào)市場隨機購買。

細(xì)菌DNA提取試劑盒：天根生化科技有限公司（北京）；RF-SRCA引物：北京華大基因有限公司；Eva－Green染料：安諾倫生物科技公司（北京）；Bst DNA聚合酶（large fragment）（8 000 U/mL）：美國 NEB 有限公司；Luria-Bertani液體培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽（xylose lysine desoxycholate agar，XLD）瓊脂：陸橋技術(shù)股份有限公司（北京）。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

Archimed實時熒光定量PCR儀：鯤鵬基因科技公司（北京）；Nanodrop 2000蛋白質(zhì)核酸分析儀：美國Thermo Scientific公司；BINDA2020D凝膠成像儀：北京賓達英創(chuàng)有限公司；DYY-8C型電泳儀：北京市六一儀器廠；DK-8D三孔電熱恒溫水槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物的設(shè)計

在NCBI中選取同源性最高的志賀氏菌特異性基因ipaH的基因序列，利用Primer premier 6.0和DNAMAN進行引物的篩選與設(shè)計。引物由北京華大基因有限公司合成，引物信息如表2所示。

表2 RF-SRCA和SRCA方法的引物Table 2 Primers of RF-SRCA and SRCA methods

1.2.2 菌株培養(yǎng)和DNA提取

將志賀氏菌菌株（ATCC12022）劃線于XLD瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)20 h～48 h，挑取單菌落接種于Luria-Bertani液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，取1 mL菌液使用提取細(xì)菌DNA試劑盒進行DNA提取。使用Nanodrop 2000蛋白質(zhì)核酸分析儀測定提取的DNA純度和濃度。表1中其它菌株同上操作，提取的DNA于-20℃保存?zhèn)溆?。另? mL志賀氏菌菌液用9 mL無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，選取可計數(shù)范圍內(nèi)的3個稀釋度菌液，每個稀釋度3個平行，用平板計數(shù)的方法進行初始菌落計數(shù)。

1.2.3 反應(yīng)體系與反應(yīng)條件

RF-SRCA 的反應(yīng)體系：dNTPs（2.5 mmol/L）添加量為 4.5 μL，Bst DNA 聚合酶添加量為 1.0 μL，Bst DNA聚合酶反應(yīng)緩沖液添加量為2.5 μL，20×EvaGreen染料添加量為1.0μL，MgSO4（20mmol/L）添加量為2.0μL，正反向引物（10 μmol/L）添加量各為 1.0 μL，模板 DNA添加量為1.0 μL，無菌雙蒸水補足體積到20 μL。陰性對照用無菌雙蒸水代替模板DNA。

RF-SRCA的反應(yīng)條件：首先將模板DNA在PCR儀中94℃預(yù)變性3 min，4℃冷卻2 min。預(yù)變性后的模板與 dNTPs、MgSO4、10 × Thermo Pol Reaction Buffer、引物、Bst DNA聚合酶和無菌雙蒸水添加到200 μL離心管中，并于避光環(huán)境下加入1 μL EvaGreen（20×）染料，最后放入實時熒光定量PCR儀中。實時熒光定量PCR儀程序為64℃進行15 s，64℃進行1 min，每次循環(huán)結(jié)束采集一次信號，循環(huán)40次。結(jié)果以擴增曲線為“S”型且循環(huán)閾值（cycle threshold，Ct值）在 5～30之間為陽性，否則為陰性。對擴增后的產(chǎn)物進行64℃～96℃的熔解曲線分析，熔解曲線為單峰且熔解溫度（melt temperature，Tm值）在80℃～90℃之間說明引物特異性較好，擴增產(chǎn)物單一。

SRCA反應(yīng)體系如上述RF-SRCA反應(yīng)體系，反應(yīng)過程使用水浴鍋64℃加熱60 min；82℃滅酶活2 min以終止反應(yīng)。將SRCA反應(yīng)擴增產(chǎn)物用濃度為2.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳驗證，凝膠電泳圖出現(xiàn)清晰的梯形條帶為陽性，否則為陰性。

1.2.4 RF-SRCA方法特異性試驗

本研究使用32株菌株對RF-SRCA方法進行特異性驗證，其中包括13株志賀氏菌和19株非志賀氏菌。實時熒光曲線法確定RF-SRCA的特異性。

1.2.5 RF-SRCA方法靈敏度試驗

經(jīng)測定，1.2.2中提取的志賀氏菌DNA純度A260/A280為1.858，濃度為5.97×107fg/μL。將其使用無菌DNA稀釋液進行10倍梯度稀釋至5.97×10-1fg/μL。分別使用RF-SRCA和SRCA方法進行檢測，根據(jù)實時熒光曲線法測定RF-SRCA方法靈敏度，凝膠電泳圖測定普通SRCA靈敏度，將RF-SRCA的靈敏度同SRCA方法進行比較。

1.2.6 RF-SRCA方法檢出限試驗

取1 mL 1.2.2中過夜培養(yǎng)的志賀氏菌菌液（8.6×109CFU/mL）加入到9 mL滅菌后的牛奶中，混勻后從中取1 mL加入9 mL無菌牛奶中連續(xù)10倍梯度稀釋至8.6×10-1CFU/mL。使用試劑盒提取DNA，各取1 μL作為反應(yīng)模板，分別進行RF-SRCA和SRCA試驗，將RF-SRCA的檢出限同SRCA方法進行比較。

1.2.7 RF-SRCA方法對實際樣品的檢測與評估

為了評估RF-SRCA方法檢測志賀氏菌的適用性，在當(dāng)?shù)馗鞒泻娃r(nóng)貿(mào)市場采集60份食品樣品，包括25份蔬菜和蔬菜沙拉、20份牛奶、15份肉制品。將樣品均質(zhì)后于37℃培養(yǎng)8 h，取1 mL的均質(zhì)液使用試劑盒提取DNA。以提取的DNA為模板，以GB/T 47895—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗志賀氏菌檢驗》為參考，用SRCA方法和RF-SRCA方法進行實際樣品檢測。并用敏感性、特異性和符合率對RF-SRCA方法評估，計算公式參考文獻[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 RF-SRCA方法特異性分析

RF-SRCA方法引物的設(shè)計篩選決定檢測方法的特異性。本研究選擇32株菌株進行RF-SRCA反應(yīng)，包括13株志賀氏菌和19株沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特桿菌等非志賀氏菌。RF-SRCA方法的特異性結(jié)果見圖1。

圖1 RF-SRCA方法的特異性結(jié)果Fig.1 Specificity results of RF-SRCA method

如圖1A所示1～13號志賀氏菌Ct值在13左右且曲線為“S”型，故確定為陽性結(jié)果，而14～32號非志賀氏菌沒有擴增為陰性結(jié)果。圖1B所示1～13號志賀氏菌的熔解曲線呈單峰Tm值在85℃左右，14～32號非志賀氏菌無單峰出現(xiàn)，證明該方法的特異性良好。

2.2 RF-SRCA方法靈敏度分析

按照1.2.3方法進行RF-SRCA和SRCA反應(yīng)，靈敏度擴增結(jié)果見圖2。

圖2 RF-SRCA和SRCA靈敏度擴增結(jié)果Fig.2 RF-SRCA and SRCA sensitivity amplification results

RF-SRCA擴增曲線如圖2A，DNA濃度為5.97×106fg/μL～5.97 × 100fg/μL（曲線 1～7）擴增曲線呈“S”型為陽性結(jié)果；DNA濃度為5.97×10-1fg/μL（曲線8）時為陰性結(jié)果。故RF-SRCA擴增曲線方法檢測志賀氏菌的靈敏度為5.97×100fg/μL。普通SRCA擴增產(chǎn)物通過凝膠電泳進行判斷，由圖2B可知凝膠電泳條帶隨著模板濃度變低條帶亮度變暗，在DNA濃度小于5.97×101fg/μL（圖 2B 序號 7、8）時沒有條帶產(chǎn)生，故可知SRCA凝膠電泳的靈敏度為5.97×101fg/μL。由此可知，RF-SRCA的靈敏度比普通SRCA反應(yīng)靈敏度高10倍。

2.3 RF-SRCA方法檢出限分析

RF-SRCA方法檢測人工污染志賀氏菌的牛奶檢出限，由平板計數(shù)法測得志賀氏菌純培養(yǎng)物的活菌數(shù)為8.6×109CFU/mL，進行10倍梯度稀釋至8.6×10-1CFU/mL。RF-SRCA和SRCA檢出限擴增結(jié)果見圖3。

圖3 RF-SRCA和SRCA檢出限擴增結(jié)果Fig.3 RF-SRCA and SRCA detection limit amplification results

如圖3A所示，牛奶中志賀氏菌濃度小于8.6×100CFU/mL時（曲線8）為陰性結(jié)果，故RF-SRCA檢測牛奶中的志賀氏菌的檢出限為8.6×100CFU/mL。SRCA方法檢出限結(jié)果如圖3B，當(dāng)人工污染牛奶中的志賀氏菌濃度小于8.6×101CFU/mL（序號7、8）時，沒有出現(xiàn)梯形條帶，故判定為陰性。因此，普通SRCA凝膠電泳檢測人工污染的牛奶檢出限為8.6×101CFU/mL。經(jīng)過比較RF-SRCA檢出限比普通SRCA低10倍。

2.4 實際樣品檢出率分析

RF-SRCA、SRCA和國標(biāo)法檢測60份實際樣品結(jié)果如表3所示。

表3 3種方法60份實際樣品檢出率比較Table 3 Comparison of detection rates of 60 samples of three methods

RF-SRCA和傳統(tǒng)SRCA方法陽性樣品檢出率和檢出樣品一致。RF-SRCA一般反應(yīng)0.17 h～0.50 h即可出現(xiàn)擴增結(jié)果，而傳統(tǒng)SRCA反應(yīng)1 h后進行凝膠電泳確定擴增結(jié)果，需要2.0 h左右，RF-SRCA比SRCA的檢出時間更短。RF-SRCA和SRCA方法檢測60份食品樣品中的志賀氏菌結(jié)果相同，檢出的陽性樣品是蔬菜沙拉，而經(jīng)過高溫滅菌的熟食和牛奶中沒有檢出。

以GB/T 4789.5—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗志賀氏菌檢驗》為參考，RF-SRCA比其多一份陽性，沒有假陰性，可得陽性檢出率為3.33%，敏感性為100%，特異性為98.31%，符合率為98.33%?？赡苁窃摲椒`敏度較高或樣品中存在活的但不可培養(yǎng)（viable but non-culturable，VBNC）狀態(tài)的志賀氏菌。綜上，RF-SRCA方法滿足實際樣品檢測的需要，靈敏度高且檢測時間較短。

3 結(jié)論與討論

本研究針對志賀氏菌特異性基因ipaH設(shè)計了一對引物，進行RF-SRCA擴增反應(yīng)。對RF-SRCA法進行特異性檢測：志賀氏菌為陽性檢測結(jié)果，其它非志賀氏菌為陰性結(jié)果，證明該方法特異性良好。RF-SRCA的靈敏度為 5.97×100fg/μL，檢出限為 8.6×100CFU/g，靈敏度比普通SRCA方法高10倍，檢出限比普通SRCA低10倍。RF-SRCA方法檢測實際樣品比國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢出率高1.66%，進一步說明該方法靈敏度較高。

根據(jù)文獻報道qPCR方法和實時熒光LAMP（realtime fluorescence LAMP，RF-LAMP） 檢測志賀氏菌，檢出限均為102CFU/mL數(shù)量級[23-24]。RF-SRCA與其相比，檢出限在數(shù)量級上低100倍。與實時熒光重組酶聚合酶擴增技術(shù)（real-time fluorescence recombinase polymerase amplification，RF-RPA）[25]相比，RF-SRCA 只需要Bst DNA聚合酶參與反應(yīng)，而RF-RPA需要重組酶和聚合酶完成擴增反應(yīng)，檢測成本較高。因此，RFSRCA檢測方法靈敏度高、簡便經(jīng)濟、準(zhǔn)確高效。

綜上，本研究建立檢測志賀氏菌的RF-SRCA方法是一種操作簡單、高特異性、高靈敏度、低檢出限的快速檢測方法，在致病菌檢測方面具有很廣闊的應(yīng)用前景，為致病菌檢測提供了新的思路，在食品檢驗領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價值。