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    啤酒糟中醇溶蛋白的提取及氨基酸組成分析

    2021-09-12 10:34:10閔建華陳世乾冉強波石強
    食品研究與開發(fā) 2021年14期
    關(guān)鍵詞:液料啤酒乙醇

    閔建華,陳世乾,冉強波,石強

    (湖北理工學院化學與化工學院,湖北 黃石 435000)

    世界上每年啤酒的產(chǎn)銷量是各種酒類之首,2018年全年我國啤酒累計產(chǎn)量達到3 812.2萬千升,是世界主要啤酒生產(chǎn)國和消費國之一[1]。啤酒糟作為啤酒釀造中的主要副產(chǎn)物,我國每年產(chǎn)出含水量在80%左右的啤酒糟約為300萬噸。啤酒糟中主要成分為蛋白質(zhì)、膳食纖維、糖類等,如不對其加以利用而直接丟棄,不僅會造成資源浪費,還會帶來嚴重的環(huán)境污染。

    啤酒糟中蛋白質(zhì)含量在15%~25%之間,主要為醇溶蛋白、谷蛋白、清蛋白和球蛋白4種蛋白質(zhì)[2-4]。其中醇溶蛋白占總蛋白40%~60%,不溶于水,具有較好耐熱性、成膜性、膨脹性和抗氧化性,可用于保鮮、防靜電、抗紫外線、隔氧、防潮等方面[5-9],并且具有一定的抑菌效果。近年來,啤酒糟除了用于飼料外,還用于發(fā)酵原料和人工栽培基料提供碳源和氮源[2-3],啤酒糟中營養(yǎng)物質(zhì)的提取及利用也受到越來越多的關(guān)注[10-15]。通過響應(yīng)面法優(yōu)化醇溶蛋白的提取工藝,并對其氨基酸組成進行測定分析,為啤酒糟綜合開發(fā)利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    啤酒糟:湖北理工學院化學與化工學院發(fā)酵實驗室自制;無水乙醇、茚三酮(分析純):國藥集團化學試劑有限公司。

    DHG-Ш型電熱恒溫鼓風干燥箱:上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;AR2140電子天平:梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;D2F-6000真空干燥箱:湖北科學器材公司;UV-2700紫外分光光度計:島津中國公司;TGL-16G臺式離心機:杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司;121MB型氨基酸自動分析儀:BECAMAN公司。

    1.2 方法

    1.2.1 啤酒糟醇溶蛋白提取

    取一定量啤酒糟干粉,過40目篩,采用超聲輔助法提取啤酒糟醇溶蛋白[16-17]。

    1.2.2 標準蛋白曲線的制作

    參考文獻[2,6],測定不同濃度的標準蛋白質(zhì)溶液在595 nm處吸光度值,以不同濃度對應(yīng)吸光度值繪制標準曲線。

    1.2.3 啤酒糟醇溶蛋白提取率的計算

    采用 65%的乙醇溶液,液料比為 4∶1(mL/g),經(jīng)過超聲處理20 min,進行浸提,在4 000 r/min條件下離心15 min,收集上清液,重復(fù)上述操作3次,合并3次收集的上清液,經(jīng)減壓蒸餾,冷凍干燥后得到粗醇溶蛋白粉,595 nm處測定吸光度,可得提取醇溶蛋白質(zhì)量,采用下式計算提取率[9]。

    1.2.4 單因素試驗

    稱取5.0 g啤酒糟干粉進行試驗,分別研究不同的乙醇體積分數(shù)、超聲時間、液料比對醇溶蛋白提取率的影響。各因素水平取值分別為:乙醇體積分數(shù)55%、60%、65%、70%、75%、80%;液料比 1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1(mL/g);超聲時間 5、10、20、30、40、50 min。

    1.2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化試驗方案

    采用響應(yīng)面法對試驗數(shù)據(jù)進行處理,選用Box-Behken模型對乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲時間等影響因素進行響應(yīng)面設(shè)計,以醇溶蛋白提取率為響應(yīng)值進行優(yōu)化。具體因素水平見表1。

    表1 醇溶蛋白提取響應(yīng)面因素水平設(shè)計Table 1 Response surface factor level design of gliadin extraction

    1.2.6 氨基酸含量的測定

    采用GB 5009.124—2016《食品安全國家標準食品中氨基酸的測定》中氨基酸的測定方法,對提取的醇溶蛋白采用氨基酸分析儀進行氨基酸含量的測定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗

    2.1.1 乙醇體積分數(shù)對大麥醇溶蛋白提取率的影響乙醇體積分數(shù)對醇溶蛋白提取率的影響見圖1。

    圖1 乙醇體積分數(shù)對醇溶蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of ethanol volume fraction on the extraction rate of alcohol-soluble protein

    大麥醇溶蛋白主要為單鏈蛋白,多由非極性氨基酸構(gòu)成,無亞基結(jié)構(gòu)和肽鏈間二硫鍵,肽與肽之間主要通過氫鍵和疏水鍵相互作用。因含有較多疏水性殘基導(dǎo)致醇溶蛋白有較高的疏水性,而易溶解于非極性溶劑中[18-20]。由圖1可知,隨著乙醇體積分數(shù)的增加,蛋白質(zhì)提取率逐漸增大,在乙醇體積分數(shù)達到65%時,醇溶蛋白提取率達到最大值1.4%,因此本試驗選擇乙醇體積分數(shù)為65%作為醇溶蛋白提取適宜溶劑濃度。

    2.1.2 液料比對醇溶蛋白提取率的影響

    液料比對醇溶蛋白提取率的影響見圖2。

    圖2 液料比對醇溶蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of the ratio of liquid to solid on the extraction rate of alcohol-soluble protein

    由圖2可見,隨著液料比的增加,醇溶蛋白提取率逐漸增大,在液料比為 4∶1(mL/g)時,醇溶蛋白的提取率達到最大值1.37%。之后,在液料比繼續(xù)增加的情況下,醇溶蛋白的提取率不再增大,說明醇溶蛋白在液料比為4∶1(mL/g)時已被充分提取,繼續(xù)增加液料比,會造成溶劑等資源的浪費,因此本試驗選擇液料比為4∶1(mL/g)作為醇溶蛋白提取適宜液料比。

    2.1.3 超聲時間對醇溶蛋白提取率的影響

    超聲時間對醇溶蛋白提取率的影響見圖3。

    圖3 超聲時間對醇溶蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic duration on extraction rate of alcoholsoluble protein

    由圖3可知,隨著超聲時間的增加,醇溶蛋白提取率逐漸增大,超聲波處理可對蛋白質(zhì)產(chǎn)生強有力的物理作用,隨著超聲波處理的進行,使得醇溶蛋白更容易分散到溶劑中被提取出來。在超聲時間為30 min時,醇溶蛋白提取率達到最大值1.38%,之后隨著時間的延長,醇溶蛋白提取率變化不大。因此本試驗選擇超聲波提取時間為30 min,作為醇溶蛋白提取適宜超聲時間。

    2.2 響應(yīng)面優(yōu)化方案

    2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

    在單因素試驗基礎(chǔ)上利用Design-Expert 8.6.0軟件按照Box-Behnken原理進行響應(yīng)面設(shè)計,試驗方案及結(jié)果見表2。

    表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

    續(xù)表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果Continue table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

    2.2.2 回歸方程的建立與檢驗

    根據(jù)表2,利用Design-Expert 8.6.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析,由此得到提取大麥醇溶蛋白對乙醇體積分數(shù)、液料比、超聲時間的二次多項回歸方程為:Y=1.45+0.043A-5.687×10-3B+0.028C-2.325×10-3AB+4.475×10-3AC-0.021BC-0.13A2-0.14B2-0.13C2。

    對回歸模型各項方差進行分析,結(jié)果見表3。

    表3 回歸模型各項方差分析Table 3 Analysis of variance of each regression model

    通過表3方差分析可以看出,該模式P<0.001,表明二次回歸方程模型極顯著,模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7,校正決定系數(shù)R2Adj=0.920 9,表明模型實際值與預(yù)測值擬合良好,失擬項P=0.673 5>0.05,失擬不顯著,試驗誤差小,因此可用該模型對醇溶蛋白提取試驗進行分析與預(yù)測。

    各因素對醇溶蛋白提取率的影響都極顯著,表明乙醇體積分數(shù)、液料比和超聲時間對大麥醇溶蛋白提取率影響較大;超聲時間與乙醇體積分數(shù)、超聲時間與液料比、液料比與乙醇體積分數(shù)都存在交互作用,因此表明各因素對大麥醇溶蛋白提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。

    2.2.3 雙因素交互作用分析

    液料比和乙醇體積分數(shù)的交互作用響面圖見圖4。

    圖4 液料比和乙醇體積分數(shù)的互交作用Fig.4 Interaction between liquid-solid ratio and ethanol volume fraction

    超聲時間和乙醇體積分數(shù)的交互作用響應(yīng)面圖見圖5。

    圖5 超聲時間和乙醇體積分數(shù)的交互作用Fig.5 Interaction between ultrasonic time and ethanol volume fraction

    超聲時間和液料比的交互作用響應(yīng)面圖見圖6。

    圖6 超聲時間和液料比的交互作用Fig.6 Interaction between ultrasonic time and liquid-solid ratio

    由圖4可知,當超聲時間固定在26 min時,液料比與乙醇體積分數(shù)的交互作用顯著,在所選范圍內(nèi)有極值;由圖 5 可知,液料比固定為 4∶1(mL/g)時,乙醇體積分數(shù)與超聲時間交互作用明顯,醇溶蛋白提取率隨著時間的作用效果延長而增加,當超聲時間為26 min左右,乙醇體積分數(shù)為64%時,醇溶蛋白提取率最大;由圖6顯示,當乙醇體積分數(shù)為65%時,醇溶蛋白提取率受液料比和超聲時間的影響較大。醇溶蛋白提取率隨著液料比、超聲時間的增加而變大,當液料比為4∶1(mL/g),超聲時間為 26 min 左右時,醇溶蛋白提取率最大,為1.35%左右

    2.2.4 優(yōu)化提取工藝參數(shù)的驗證

    采用Design-Expert 8.6.0軟件,分析得到的最佳工藝提取條件是:超聲時間26.66 min,液料比4.45∶1(mL/g),乙醇體積分數(shù)63.26%。在此條件下大麥醇溶蛋白提取率為1.45613%。考慮到實際操作條件,確定最佳提取條件為超聲時間27 min,液料比為4.5∶1(mL/g),乙醇體積分數(shù)為64%。經(jīng)過3次平行試驗,醇溶蛋白的提取率為1.4%,與理論值相差不大。

    2.3 氨基酸成分分析

    啤酒糟醇溶蛋白氨基酸組成見表4。87.7%,必需氨基酸含量在20.52%,非必需氨基酸含量為67.18%。含量最高氨基酸為谷氨酸,含量達到40.221%,其次為脯氨酸,含量為12.991%,而作為糧食作物的第一限制性氨基酸賴氨酸含量為0.889%,含量較低。

    表4 啤酒糟醇溶蛋白氨基酸組成Table 4 Amino acid composition of gliadin

    啤酒糟醇溶蛋白氨基酸評分見表5。

    表5 啤酒糟醇溶蛋白氨基酸評分Table 5 Score of gliadin amino acids

    由表5可知,根據(jù)世界衛(wèi)生組織建議,以雞蛋蛋白質(zhì)所含氨基酸比例為標準,評分為100分,對啤酒糟醇溶蛋白氨基酸進行評分,得分為46.7分,低于常見大豆蛋白氨基酸得分74分。結(jié)合表4結(jié)果,啤酒糟醇溶蛋白中必需氨基酸含量占總氨基酸含量23.4%,必需氨基酸含量占非必需氨基酸含量的30.5%,而聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織建議,理想蛋白質(zhì)以上兩項占比分別要大于36%和60%[20],說明啤酒糟醇溶蛋白氨基酸比例不理想,沒有達到理想蛋白質(zhì)氨基酸比例要求,限制了啤酒糟在食品營養(yǎng)方面的應(yīng)用。但是,啤酒糟醇溶蛋白含較多疏水性氨基酸,蛋白質(zhì)之間主要通過氫鍵和疏水鍵相互作用,使蛋白質(zhì)分子間具有一定的水不溶性及延伸性,可通過一定技術(shù)手段制成天然高分子膜在食品保鮮等方面得到很好的應(yīng)用[5,21-25]。

    3 結(jié)論

    在單因素分析基礎(chǔ)上,通過響應(yīng)面法對大麥醇溶蛋白的提取工藝進行優(yōu)化設(shè)計,通過Box-Behnken試驗設(shè)計建立數(shù)學模型,并進行響應(yīng)面分析,得出最佳提取工藝:超聲時間 27 min,液料比 4.5∶1(mL/g),乙醇體積分數(shù)64%,此時最大醇溶蛋白提取率為1.4%。通過該法提取啤酒糟中醇溶蛋白,技術(shù)手段簡單,提取效率較高,可為啤酒糟的工業(yè)化綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。通過對啤酒糟醇溶蛋白氨基酸含量及比例進行分析,得出啤酒糟醇溶蛋白在食品營養(yǎng)學方面不是一種良好蛋白質(zhì)來源,但是因其特殊的氨基酸組成,使其具有柔軟、可食,黏稠及高彈性,可在食品保鮮、包裝及制藥等領(lǐng)域得到很好的應(yīng)用。

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