黑果腺肋花楸黃酮提取物修復(fù)小鼠急性酒精肝損傷的研究

郝思奧，李艷，2*，賀艷楠，吳楠

（1.河北科技大學(xué)食品與生物學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河北 石家莊 050018）

黑果腺肋花楸是一種新型的藥食兼用漿果，其營養(yǎng)豐富，富含膳食纖維、蛋白質(zhì)、糖類和多酚等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。黑果腺肋花楸中的酚類物質(zhì)，尤其是黃酮類物質(zhì)含量豐富，這些黃酮類化合物已經(jīng)被證實具有良好抗氧化性[2-3]、抑菌消炎性[4-5]、抗癌、抗腫瘤[6-7]、降血壓、降血糖[8-9]、預(yù)防和治療消化系統(tǒng)疾病[10]及保護心血管[11]等多種藥用功效。目前，我國對于黑果腺肋花楸資源的開發(fā)主要集中于種植技術(shù)的優(yōu)化[12-13]、果實成分的提取[14-15]、黑果腺肋花楸食品或飲料的加工[16-17]等方面。在黑果腺肋花楸活性物質(zhì)生理功能方面，主要集中在抗氧化性研究[2-3]和抗菌性[4]研究，其它功能相關(guān)研究較少且欠深入。

隨著人們生活水平的提高與現(xiàn)代社交的發(fā)展，酒精肝損傷已成為影響人們?nèi)粘Ｉ畹某０l(fā)疾病[18]。研究證實黃酮類化合物對酒精肝損傷有保護或治療作用[18-20]。雷斯瑀等[18]研究發(fā)現(xiàn)趕黃草總黃酮提取物對小鼠酒精性肝損傷有較好的治療作用；陳發(fā)菊等[19]研究證實藤茶總黃酮對酒精性肝損傷小鼠具有一定保護作用，可能與增加肝組織抗氧化酶的活性、降低脂質(zhì)過氧化水平、降低肝組織IL-4、IL-6、TNF-α等炎癥因子水平有關(guān)；李志超等[20]研究證實矮地茶黃酮通過降低肝組織的損傷和炎癥程度、減少脂質(zhì)過氧化，提高機體抗氧化能力，防止氧化應(yīng)激的發(fā)生，改善酒精對大鼠造成的脂質(zhì)代謝紊亂來發(fā)揮護肝作用。黑果腺肋花楸黃酮是否對酒精肝損傷有保護及修復(fù)作用，目前國內(nèi)尚無相關(guān)研究。本研究以黑果腺肋花楸為原料，提取黃酮類化合物，通過建立急性酒精肝損傷小鼠模型，研究黑果腺肋花楸黃酮提取物對急性酒精肝損傷的修復(fù)能力，為黑果腺肋花楸功能產(chǎn)品的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物與原料

昆明小鼠，體重18 g～22 g，SPF級，雄鼠：河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。動物質(zhì)量合格許可證號：SCXK（冀）2013-1-003。小鼠飼養(yǎng)于溫度和濕度適宜的清潔級動物房，自由進(jìn)食與飲水。

黑果腺肋花楸果實：秦皇島金樽酒業(yè)有限公司，產(chǎn)自河北省盧龍縣。

1.1.2 試劑及試劑盒

甲醛、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、無水乙醇（均為分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、總抗氧化能力（total antioxidant capacity，T-AOC）試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

101-0AB電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ES-188ZL電子顯微鏡：麥克奧迪實業(yè)集團有限公司；EPOCH2酶標(biāo)儀：美國博騰儀器有限公司；AR1140電子分析天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司；TDL-5-A離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠；DELTA320 pH數(shù)字酸度計：梅普勒-托利多儀器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵、Re-2O1旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、2O1升降恒溫水浴鍋：河南省鞏義市英峪予華儀器廠；1290-6420超高壓液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技（中國）有限公司

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸黃酮類化合物提取

黑果腺肋花楸中黃酮類化合物提取工藝：料液比1∶15（g/mL），乙醇體積分?jǐn)?shù) 50%，共提取 2次，提取溫度分別為65℃和75℃、提取時間均為80 min、提取時均超聲波處理，超聲功率90 W。黑果腺肋花楸醇提液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮并回收乙醇，所得剩余液為黃酮提取物濃縮液。

1.3.2 黑果腺肋花楸黃酮提液成分檢測

參照陳家鵬[21]方法測定黑果腺肋花楸濃縮醇提液中總黃酮含量，參照于海波[22]、孫冰婷等[23]的方法進(jìn)一步確定黃酮濃縮液的黃酮類物質(zhì)成分。

1.3.3 酒精誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型建立

將55只體重為18 g～22 g的昆明小鼠（雄鼠）隨機分置在5個鼠籠中，進(jìn)行1周適應(yīng)性喂養(yǎng)后，稱重并按體重均分為正常組、模型組、低劑量組、高劑量組和藥物組，藥物組所用藥物為水飛薊素。分組后繼續(xù)喂養(yǎng)（食水不限）28 d，灌胃劑量見表1，連續(xù)灌胃，每日1次。第22天開始，按表1對相應(yīng)組的小鼠灌胃酒精，劑量為12 mL/kg BW，連續(xù)灌胃7 d，最后1次灌胃后空腹（禁食不禁水）16 h，稱重，并在眼球取血后頸椎脫臼處死，存留小鼠血清及肝臟組織，備用。

表1 小鼠灌胃劑量Table 1 Intragastric doses in mices

1.3.4 檢測方法

小鼠血清酶活性測定：谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性、丙二醛（MDA）含量、總抗氧化能力（T-AOC）均用試劑盒按照其提供的方法進(jìn)行。

肝臟組織酶活性測定：取肝組織稱重，加入9倍量生理鹽水，冰水浴條件下機械勻漿后2 500 r/min離心10 min，取上清液按照試劑盒提供方法檢測谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的活性、丙二醛（MDA）含量和總抗氧化能力（T-AOC）。

1.3.5 肝組織病理學(xué)觀察

處死小鼠后迅速取出肝臟，取肝左葉相同部位一小塊組織，用4%甲醛溶液固定，酒精脫水、浸蠟、包埋、切片并用蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）法染色，制成病理切片，電子顯微鏡觀察各組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)及肝小葉結(jié)構(gòu)并攝片。

1.4 數(shù)據(jù)處理

研究數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS 23.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行T-檢測及單因素方差分析，p<0.05表示具有顯著差異，p<0.01表示具有極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑果腺肋花楸黃酮提取液中總黃酮含量及活性成分檢測結(jié)果

經(jīng)檢測，黑果腺肋花楸黃酮提取濃縮液中總黃酮含量為69.12 mg/mL，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）檢測黃酮物質(zhì)成分結(jié)果見表2。

表2 黃酮提取物（濃縮液）黃酮類物質(zhì)組成及含量檢測結(jié)果Table 2 Determination of composition and concentration of flavonoids in concentrated flavonoid extraction

黑果腺肋花楸黃酮提取物中共檢測出4種黃酮類化合物，分別是綠原酸、山奈酚、槲皮素和蘆丁，其中綠原酸含量最高，約占總黃酮化合物的78%，其次為蘆丁。

2.2 黃酮提取液對酒精肝損傷小鼠肝組織中各項指標(biāo)的影響

酒精經(jīng)腸胃吸收可直接進(jìn)入肝臟參與代謝，增強肝組織中超氧陰離子自由基、羥基自由基等的生成[24]，引起脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，產(chǎn)生MDA，并抑制肝臟內(nèi)如GSH-Px等抗氧化劑的生成，使肝組織發(fā)生病變，從而引起肝臟中AST及ALT活性的升高[24]，聯(lián)合檢驗肝組織中各指標(biāo)可準(zhǔn)確反映肝組織的生理狀況，結(jié)果見表3。

表3 肝組織AST、ALT、GSH-Px活性及MDA含量和總抗氧化能力Table 3 AST activities，ALT activities，GSH-Px activities，MDA content and total antioxidant capacity in liver tissues

由表3可知，模型組小鼠的丙二醛含量、AST活性（p<0.05）、ALT活性（p<0.01）均高于正常組；GSH-Px活性與總抗氧化能力低于正常組，可見急性酒精肝損傷小鼠模型建立成功。

低劑量組小鼠肝組織AST活性（p<0.05）、ALT活性低于與模型組，表明低劑量黑果腺肋花楸黃酮提取液飼喂對酒精導(dǎo)致肝損傷的小鼠肝組織轉(zhuǎn)氨酶活性上升有顯著緩解作用，證實黑果腺肋花楸黃酮提取液有保肝護肝功效。低劑量組GSH-Px指標(biāo)較正常組與模型組均有顯著升高，說明低劑量黃酮提取物不僅可改善酒精肝損傷，也可增強機體抗氧化能力。低劑量組丙二醛含量較正常組與模型組均有下降，總抗氧化能力較正常組與模型組均有提高，實驗結(jié)果表明，低劑量黃酮提取物飼喂可以增強小鼠體內(nèi)抗氧化能力，同時對其肝臟有顯著的保護作用。

高劑量組AST活性和ALT活性與模型組相比沒有下降，表明黑果腺肋花楸黃酮提取物保肝功效的發(fā)揮有劑量限值，當(dāng)濃度過高時，無法起到保肝作用，這一現(xiàn)象也被很多研究所證實[25-28]。高劑量組MDA含量與正常組相比沒有下降，T-AOC指標(biāo)也低于正常組，表明劑量過高時，體內(nèi)抗氧化能力銳減甚至無法起到作用。

藥物組亦無法抑制酒精肝損傷導(dǎo)致的AST、ALT兩項指標(biāo)的升高，GSH-Px活性極顯著高于模型組，MDA含量低于模型組，但T-AOC極顯著弱于模型組，表明所用藥物對小鼠酒精肝損傷修復(fù)作用甚微，且無法顯著提升小鼠機體的抗氧化能力。

2.3 黃酮提取液對酒精肝損傷小鼠血清中各項指標(biāo)的影響

肝細(xì)胞膜受損或肝細(xì)胞發(fā)生壞死時，肝中轉(zhuǎn)氨酶會進(jìn)入血清使血清中酶活增高，檢驗血清中轉(zhuǎn)氨酶活性，可間接反映肝組織損傷程度。聯(lián)合檢驗血清中MDA含量、GSH-Px活性及T-AOC，可進(jìn)一步反映肝組織受損狀況及小鼠機體抗氧化能力。實驗所得結(jié)果見表4。

表4 血清AST、ALT、GSH-Px活性及MDA含量和總抗氧化能力Table 4 AST activities，ALT activities，GSH-Px activities，MDA content and total antioxidant capacity in serum

由表4可得，模型組小鼠血清中AST、ALT活性高于正常組，即肝損傷導(dǎo)致的細(xì)胞壞死或細(xì)胞膜破損使肝臟中轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)入血清，使血清中轉(zhuǎn)氨酶活性升高，肝損傷模型建立成功。模型組GSH-Px活性（p<0.05）、T-AOC低于正常組，MDA含量高于正常組，說明酒精導(dǎo)致的肝損傷，也間接影響機體抗氧化能力。

低劑量組小鼠血清AST、ALT活性低于模型組，與肝組織指標(biāo)所得結(jié)論一致，即低劑量（60 mg/kg BW）黑果腺肋花楸黃酮提取液有優(yōu)良保肝功效。GSH-Px活性和T-AOC較模型組有所提高，MDA含量低于模型組，表明黑果腺肋花楸黃酮提取物可增強小鼠機體抗氧化能力，具有一定體內(nèi)抗氧化特性。

高劑量組AST、ALT活性較模型組略微下降，保肝效果不如低劑量組明顯。GSH-Px活性（p<0.01）與TAOC較模型組有提升，也可進(jìn)一步證實提取物的體內(nèi)抗氧化性能。

藥物組AST活性均顯著高于正常組與模型組（p<0.01），ALT活性小于模型組，GSH-Px活性均顯著高于正常組與模型組（p<0.01），MDA含量較模型組也有所降低，體內(nèi)總抗氧化能力低于模型組，可知本實驗所用藥物無法對小鼠起到保肝作用，也無法顯著提升小鼠機體抗氧化能力。

2.4 黃酮提取液對酒精肝損傷小鼠肝組織病變的影響

小鼠肝組織切片電鏡檢測結(jié)果見圖1。

圖1 顯微鏡下5組小鼠肝組織切片F(xiàn)ig.1 Hepatic tissue sections examined under microscope of mice in five groups

由圖1 a可見小鼠肝組織結(jié)構(gòu)完整，肝索排列整齊呈放射狀分布，肝小葉及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)清晰，無顯著病變狀況；由圖1b可見小鼠部分肝小葉結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象，且肝索排列紊亂不齊，符合急性酒精肝損傷特征；圖1c及圖1d中小鼠肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，呈放射狀分布，細(xì)胞損傷狀況明顯改善、壞死細(xì)胞減少；圖1e與圖1b相比，仍可見部分肝小葉被破壞，仍有細(xì)胞損傷、水腫現(xiàn)象，肝索排列無改善。結(jié)果表明，高、低劑量的黑果腺肋花楸黃酮提取物均可改善小鼠急性酒精肝損傷狀況，證實其具備保肝功效。而水飛薊素?zé)o明顯預(yù)防小鼠酒精肝損傷的功效。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，低劑量飼喂黑果腺肋花楸黃酮提取物可明顯緩解小鼠肝組織AST及ALT活性的升高，低、高劑量均可改善血清中AST及ALT活性升高，證實黑果腺肋花楸黃酮提取物有保肝和修復(fù)酒精引起的急性肝損傷功效，功效與其濃度相關(guān)，濃度過高時，功效減弱。肝組織病理觀察證明，不同劑量黑果腺肋花楸黃酮提取物均對小鼠急性酒精肝損傷有良好修復(fù)作用。而水飛薊素對小鼠無保肝功效。低劑量提取物可提升小鼠肝組織及血清中GSH-Px活性和TAOC，且降低肝組織中MDA含量，證明黑果腺肋花楸黃酮提取物可以增強機體抗氧化能力，具備體內(nèi)抗氧化特性，其抗氧化性能與濃度相關(guān)，濃度過高會降低其體內(nèi)抗氧化能力。而水飛薊素?zé)o法顯著提升小鼠機體抗氧化能力。