草莓灰霉病病原菌的分離鑒定及室內(nèi)毒力測定

姜莉莉，田中一久，孫瑞紅，宮慶濤，武沖

（1.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000；2.山東省現(xiàn)代設(shè)施果樹技術(shù)創(chuàng)新中心，山東 泰安 271000）

草莓（Fragaria ananassaDuchesne）屬薔薇科草莓屬多年生草本植物，其果實(shí)汁多味美、口感上佳、營養(yǎng)豐富。我國的草莓種植面積及產(chǎn)量均位居世界首位。草莓灰霉病是影響草莓安全生產(chǎn)的重要病害之一，由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）侵染引起，可危害植株所有地上部分，其中對(duì)花器、果實(shí)的侵染最重，導(dǎo)致草莓產(chǎn)量、品質(zhì)降低，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。該病原菌由分生孢子隨氣流、水及農(nóng)事操作傳播，在高濕環(huán)境下蔓延迅速［1］。張?jiān)コ龋?］報(bào)道，濕度是草莓灰霉病發(fā)生的誘導(dǎo)因素，隨著棚內(nèi)濕度增加，灰霉病菌孢子萌發(fā)率逐漸提高。適當(dāng)延長設(shè)施草莓通風(fēng)時(shí)間，降低棚內(nèi)相對(duì)濕度，可在一定程度上降低草莓灰霉病的發(fā)生和危害程度，保障果品質(zhì)量安全［3］。

目前，化學(xué)防治仍是生產(chǎn)上防治植物病害的常用及有效手段［4］。防治草莓灰霉病主要采用苯并咪唑類、甲氧基丙烯酸酯類及甾醇脫甲基抑制劑類殺菌劑。然而，由于長期頻繁且不合理用藥，草莓灰霉病已對(duì)多種殺菌劑產(chǎn)生了不同程度的抗藥性，且不同地區(qū)差異較大。劉欣等［5］報(bào)道，上海地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)啶酰菌胺的抗性水平及抗性頻率較高。貢常委等［6］報(bào)道，四川省已有部分地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈產(chǎn)生了抗藥性。趙虎等［7］報(bào)道，南京和鎮(zhèn)江地區(qū)草莓灰霉病菌對(duì)咯菌腈未產(chǎn)生抗藥性，但對(duì)多菌靈、腐霉利、乙霉威、嘧霉胺和醚菌酯產(chǎn)生了多重抗性。

山東省是我國草莓主產(chǎn)區(qū)，草莓種植面積及產(chǎn)量均居全國首位。本研究選取8種相對(duì)新型的殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，以期篩選出適用于山東省草莓灰霉病的防治藥劑，為草莓安全生產(chǎn)及病害科學(xué)防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集

草莓灰霉病樣本于2020年12月采自山東省果樹研究所金牛山試驗(yàn)基地草莓大棚，立架式無土栽培，品種為‘香野’。

1.2 供試殺菌劑及來源

95%氟硅唑原藥，江蘇中旗科技股份有限公司；97%氟環(huán)唑原藥，江蘇輝豐生物農(nóng)業(yè)股份有限公司；95%己唑醇原藥，山東濰坊潤豐化工股份有限公司；97%吡唑醚菌酯原藥，浙江宇龍生物科技股份有限公司；97%苯醚甲環(huán)唑原藥和98%肟菌酯原藥，山東省聯(lián)合農(nóng)藥工業(yè)有限公司；98%咯菌腈原藥，河北興柏農(nóng)業(yè)科技有限公司；97%咪鮮胺原藥，山東華陽農(nóng)藥化工集團(tuán)有限公司。

1.3 草莓灰霉病病原菌分離、純化

采用病組織分離法［8］將草莓灰霉病病組織剪成小段，75%乙醇中浸泡30 s，無菌水沖洗3次，置于PDA培養(yǎng)基平板上25℃黑暗培養(yǎng)2 d。待菌落形成后，挑取邊緣菌絲接種至新的PDA培養(yǎng)基平板上，進(jìn)一步純化培養(yǎng)。純化好的草莓灰霉病菌株以PDA斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆谩?/p>

將純化好的草莓灰霉病病原菌接種至PDA平板上，25℃黑暗培養(yǎng)7 d。以無菌水沖洗菌落，制備草莓灰霉病菌孢子懸浮液，并將孢子濃度調(diào)至1×106個(gè)／mL。選取移栽2個(gè)月、生長正常的盆栽‘香野’草莓植株，以75%乙醇將草莓葉片擦拭干凈，以滅菌砂紙輕磨葉片后，接種灰霉病菌孢子懸浮液。采用常規(guī)管理，觀察病害發(fā)生情況。

1.4 病原菌分子鑒定

以真菌基因組DNA提取試劑盒提取草莓灰霉病菌基因組DNA，以ITS1（5′－TCCGTAGGTGAACCTGCGG－3′）和ITS4（5′－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3′）為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系：5×PrimeSTAR Buffer（Mg2＋Plus）10 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol／L each）4μL，ITS1 1.5μL，ITS4 1.5μL，DNA 1μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U／μL）0.5μL，滅菌水補(bǔ)足至50μL。擴(kuò)增程序：94℃2 min；98℃10 s，55℃5 s，72℃1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后，與pMD18T載體連接、轉(zhuǎn)化，PCR鑒定后，挑取陽性克隆并測序。所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 室內(nèi)毒力測定

采用菌絲生長速率法測定殺菌劑室內(nèi)毒力［9］。以丙酮將供試原藥配制成有效成分濃度為1×104mg／L的母液。在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)供試藥劑母液進(jìn)行梯度稀釋。氟硅唑、氟環(huán)唑和己唑醇的試驗(yàn)濃度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.000 mg／L，吡唑醚菌酯和肟菌酯的試驗(yàn)濃度為0.500、1.000、2.500、5.000、10.000 mg／L，苯醚甲環(huán)唑的試驗(yàn)濃度為0.250、0.500、1.000、2.500、5.000 mg／L，咯菌腈的試驗(yàn)濃度為0.050、0.100、0.250、0.500、1.000 mg／L，咪鮮胺的試驗(yàn)濃度為0.125、0.250、0.500、1.000、2.500 mg／L。

在超凈工作臺(tái)上，移取1 mL各濃度藥液于49 mL滅菌后冷卻至50～60℃的PDA培養(yǎng)基中，搖勻后倒板，每濃度制備3個(gè)含藥PDA平板。從活化好的草莓灰霉病菌菌落邊緣打取直徑7 mm的菌餅，接種至PDA平板中央，以無菌水處理為對(duì)照。25℃黑暗培養(yǎng)，待對(duì)照組菌落長至2／3培養(yǎng)皿左右時(shí)，采用十字交叉法測定各處理的菌落直徑。按照以下公式計(jì)算各處理的菌絲生長抑制率（%）；采用SPSS18.0計(jì)算各藥劑的EC50值和95%置信區(qū)間；以活性最低藥劑的EC50值為基準(zhǔn)值，計(jì)算其它藥劑的相對(duì)毒力指數(shù)。

菌絲生長抑制率（%）＝（對(duì)照組菌落直徑－處理組菌落直徑）／（對(duì)照組菌落直徑－菌餅直徑）×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓灰霉病病原菌鑒定

從草莓灰霉病發(fā)病部位分離得到菌株HM－1，在PDA平板上培養(yǎng)4 d后，菌落圓形，呈地毯狀平鋪，淺白色，氣生菌絲絨狀（圖1）。

圖1 草莓灰霉病病原菌HM－1菌落

根據(jù)柯赫氏法則，將純化后的HM－1菌株孢子液接種至草莓健株葉片上，3 d后葉片出現(xiàn)褪綠現(xiàn)象，邊緣呈角型干枯，符合灰霉病發(fā)病癥狀（圖2）。

圖2 HM－1菌株回接癥狀

采用通用引物ITS1／ITS4對(duì)菌株HM－1的rDNA－ITS基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，得到長度為543 bp的DNA序列，GenBank登錄號(hào)為MZ007846。將該序列在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與葡萄孢屬（Botrytis）的同源性為100%。通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹發(fā)現(xiàn)該菌株與富克葡萄孢盤菌（Botryotinia fuckeliana）和灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）聚在一枝（圖3），其中富克葡萄孢盤菌為有性世代，灰葡萄孢菌為無性世代，因此將其鑒定為灰葡萄孢菌。

圖3 菌株HM－1 ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 8種殺菌劑對(duì)草莓灰霉病菌菌絲生長的抑制率

由表1可知，8種相對(duì)新型殺菌劑對(duì)草莓灰霉病菌菌絲生長抑制活性均較高。其中咯菌腈對(duì)草莓灰霉病菌的抑制效果最佳，有效成分濃度為0.050～1.000 mg／L時(shí)，對(duì)菌絲生長的抑制率為5.11%～74.57%。有效成分濃度為0.125～2.000 mg／L時(shí)，氟環(huán)唑?qū)Σ葺颐共【z生長的抑制率為15.75%～68.00%，氟硅唑?yàn)?4.11%～65.50%，己唑醇為8.74%～66.07%；咪鮮胺濃度為0.125～2.500 mg／L時(shí)，對(duì)草莓灰霉病菌菌絲生長的抑制率為7.91%～76.28%，抑菌活性也較高。苯醚甲環(huán)唑有效成分濃度為0.250～5.000 mg／L時(shí)，對(duì)草莓灰霉病菌的抑制率為7.21%～79.21%。有效成分濃度為0.500～10.000 mg／L時(shí)，吡唑醚菌酯對(duì)草莓灰霉病菌菌絲生長的抑制率為17.28%～67.30%，肟菌酯為10.24%～75.54%。

2.3 8種殺菌劑對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力

由表2可知，8種相對(duì)新型殺菌劑對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力均較高。其中吡唑醚菌酯對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力最低，EC50值為3.772 mg／L；咯菌腈對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力最高，EC50值為0.461 mg／L，相較于吡唑醚菌酯的相對(duì)毒力指數(shù)為8.182。氟環(huán)唑、氟硅唑、咪鮮胺和己唑醇對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力也較高，EC50值分別為0.789、0.961、0.991、1.102 mg／L，相對(duì)毒力指數(shù)分別為4.781、3.925、3.806和3.423。苯醚甲環(huán)唑和肟菌酯對(duì)草莓灰霉病菌的EC50值分別為1.781 mg／L和3.705 mg／L，相對(duì)毒力指數(shù)分別為2.118和1.018，抑菌活性較其它幾種殺菌劑略差。

表2 8種殺菌劑對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力

3 討論與結(jié)論

灰霉病是草莓生產(chǎn)過程中的一種重要病害，嚴(yán)重影響其產(chǎn)量和品質(zhì)。草莓灰霉病病原菌具有遺傳變異性大、繁殖速率高和適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，生產(chǎn)上單一、頻繁用藥極易導(dǎo)致抗藥性的產(chǎn)生［10］。為豐富生產(chǎn)上藥劑品種的選擇，同時(shí)延緩抗藥性的產(chǎn)生，本研究選取了8種相對(duì)新型的殺菌劑，對(duì)分離得到的草莓灰霉病菌（B．cinerea）HM－1進(jìn)行室內(nèi)毒力測定。結(jié)果表明，供試8種殺菌劑對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力均較高。其中咯菌腈對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力最高，EC50值為0.461 mg／L。氟環(huán)唑、氟硅唑、咪鮮胺和己唑醇對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力也較高，EC50值分別為0.789、0.961、0.991、1.102 mg／L。這與尹向田等［11］報(bào)道的不同種類殺菌劑對(duì)葡萄灰霉病菌的室內(nèi)毒力結(jié)果相近。

咯菌腈屬于苯吡咯類非內(nèi)吸性殺菌劑，防病譜較廣，主要通過抑制菌體葡萄糖磷?；磻?yīng)抑制病原菌的生長，從而導(dǎo)致病原菌死亡。氟環(huán)唑、氟硅唑和己唑醇為三唑類甾醇抑制劑類殺菌劑，咪鮮胺屬于咪唑類甾醇抑制劑類殺菌劑，均通過抑制病原菌麥角甾醇的合成，使菌體細(xì)胞膜功能受到破壞［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，咯菌腈、氟環(huán)唑、氟硅唑、咪鮮胺和己唑醇對(duì)草莓灰霉病菌的室內(nèi)毒力均較高，生產(chǎn)上可用于防治該病害。同時(shí)，還可通過及時(shí)摘除衰老花瓣［13］，加強(qiáng)通風(fēng)透光等農(nóng)業(yè)防治手段，降低草莓灰霉病的發(fā)生和為害。