• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定毒蕈中6種鵝膏毒肽類和鬼筆毒肽類毒素

    2021-09-11 00:58:21薛康胡江濤俞凌云劉菲馬麗龔婷婷華燚陳佳玥
    安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年17期
    關(guān)鍵詞:串聯(lián)質(zhì)譜法超高效液相色譜

    薛康 胡江濤 俞凌云 劉菲 馬麗 龔婷婷 華燚 陳佳玥

    摘要 [目的]建立一種基于超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)快速測(cè)定野生毒蕈中6種鵝膏毒肽和鬼筆毒肽類毒素的分析方法。[方法]將采集的四川野生毒蕈子實(shí)體低溫烘干,用甲醇超聲提取,40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干,加水復(fù)溶,Oasis HLB固相萃取小柱凈化,經(jīng)Waters HSS T3色譜柱分離,ESI正離子模式下多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式分析。[結(jié)果]6種毒肽在50~1 000 μg/kg具有良好的線性關(guān)系,相關(guān)系數(shù)均大于0.99,方法檢出限為30 μg/kg。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽、羧基三羥鬼筆毒肽在低、中、高3個(gè)濃度的平均回收率在93.1%~117.5%,變異系數(shù)(CV)在1.49%~7.77%。[結(jié)論]該方法能準(zhǔn)確、靈敏地測(cè)定野生毒蕈中6種毒肽,適用于野生菌中毒肽毒素的測(cè)定。

    關(guān)鍵詞 野生毒蕈;鵝膏毒肽;鬼筆毒肽;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

    中圖分類號(hào) R155.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

    文章編號(hào) 0517-6611(2021)17-0182-04

    doi:10.3969/j.issn.0517-6611.2021.17.048

    Abstract [Objective]To establish a method for rapid determination of 6 kinds of amanitins and phallotoxins in wild poisonous mushrooms by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).[Method]The wild mushrooms samples collected in Sichuan were dried at low temperature, the amanitins and phallotoxins in samples were extracted with methanol by ultrasonic extraction, then 40 ℃ rotary evaporation drying ,water redissolution, purified by HLB solid phase extraction column and separated on Waters HSS T3 column,lastly detected by electrospray(ESI+) in MRM mode. [Result] The 6 kinds of amanitins and phallotoxins had good linear relationships in the range of concentration 50-1000 μg/kg with the correlation coefficient value greater than 0.99.The detection limits of 6 kinds of amanitins and phallotoxins were 30 μg/kg.The average recovery rates of α-amanitin, β-amanitin,γ-amanitin, phalloidin, phallacidin and phallisacin at 3 spiked levels were 93.1%-117.5%. The coefficients of variation were 1.49%-7.77%. [Conclusion]The method can accurately and sensitively determine 6 kinds of amanitins and phallotoxins in poisonous mushrooms, which is suitable for the detection of amanitins and phallotoxins in wild mushrooms.

    Key words Wild poisonous mushrooms;Amanitins;Phallotoxins;UPLC-MS/MS

    毒蕈即日常所說(shuō)的毒蘑菇,是指不同類型的含有毒素的大型野生真菌,由于有些毒蕈在外觀上與食用菌沒(méi)有明顯區(qū)別,導(dǎo)致誤食毒蕈而引發(fā)中毒的事件時(shí)有發(fā)生,且在群體性食物中毒中,毒蕈中毒的致死率極高,其中肝損傷型毒蕈中毒致死率高達(dá)90%~100%[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國(guó)毒蕈中毒事件中,95%是由鵝膏菌屬引起的[2]。因?yàn)轾Z膏菌中含有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定且毒性極強(qiáng)的鵝膏多肽類毒素,該類毒肽耐高溫、干燥和酸堿環(huán)境,一般的烹調(diào)加工不會(huì)破壞其毒性,不幸誤食后,毒肽就會(huì)通過(guò)消化系統(tǒng)進(jìn)入肝臟,對(duì)肝臟造成嚴(yán)重的損傷,最終引發(fā)多器官功能衰竭而死亡[3-5]?,F(xiàn)階段,國(guó)內(nèi)外一般采用高效液相色譜法、高效液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜法和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)毒肽毒素[6-11],我國(guó)還沒(méi)有檢測(cè)毒肽毒素的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。因此,該研究建立了一種利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定野生毒蕈中6種毒肽毒素的檢測(cè)方法,以期為野生菌毒素檢測(cè)提供一種高效的檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    UPLC lclass-XEVOTQ-XS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Waters公司);3H20RI離心機(jī)(中國(guó)赫西);AE240電子天平(瑞士梅特勒);XW-80A旋渦混合器(中國(guó)HUXI);B8510E-DTH超聲波清洗器(美國(guó)必能信);Mili-Q Integral 3超純水儀(美國(guó)Millipore公司);ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,美國(guó)Waters公司)。

    1.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨、氯仿,HPLC級(jí),美國(guó)Fisher公司。標(biāo)準(zhǔn)品:α-鵝膏毒肽(α-amanitin,純度≥90%,瑞士Alex);β-鵝膏毒肽(β-amanitin,純度≥90%,瑞士Alex);γ-鵝膏毒肽(γ-amaniyin,純度≥90%,瑞士Alex);羧基三羥鬼筆毒肽(phallisacin,50 μg/mL,上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司);羧基二羥鬼筆毒肽(phallacidin,純度≥95%,瑞士Alex);二羥鬼筆毒肽(phalloidin,純度≥90%,瑞士Alex)。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

    1.3.1.1 α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制。 分別精確稱取α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽、羧基二羥鬼筆5種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)1 mg,精確至萬(wàn)分之一,甲醇定容至10 mL,濃度為100 μg/mL。-20 ℃存儲(chǔ)。

    1.3.1.2 鵝膏毒肽和鬼筆毒肽混合標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制。分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、二羥鬼筆毒肽和羧基二羥鬼筆毒肽儲(chǔ)備液以及2.0 mL羧基三羥鬼筆毒肽標(biāo)準(zhǔn)溶液于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,濃度為10 mg/L。

    1.3.1.3 6種毒肽混合標(biāo)準(zhǔn)系列的配制。分別吸取50、100、200、400、600、1 000 μL,用初始流動(dòng)相定容至10 mL,配制成濃度為50、100、200、400、600、1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

    1.3.2 樣品前處理。

    1.3.2.1 提取。將新鮮野生菌樣品烘干(烘干溫度小于50 ℃)并打成粉末,精密稱取干燥粉末0.2 g,置于50 mL離心管中,加入甲醇10 mL,振蕩渦旋1 min,超聲提取10 min,以10 000 r/min離心10 min后,移取上清液于另一離心管中。殘?jiān)性偌尤?0 mL甲醇,渦旋混合均勻,再次超聲提取10 min后以10 000 r/min離心,合并上清液。40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)近干,加2 mL水溶解,洗滌3次,得提取液。

    1.3.2.2 凈化。分別用2 mL甲醇和純水淋洗活化Prime Oasis HLB固相萃取柱(3 mL,60 mg),再將以上提取液過(guò)柱,用2 mL含5%甲醇的水溶液淋洗2次,最后用2 mL甲醇-乙腈混合溶液(V∶V=3∶2)洗脫。將洗脫液在40 ℃水浴中氮吹近干,用1 mL初始流動(dòng)相[甲醇-5 mmol/L 乙酸銨(0.1%甲酸)=90∶10]溶解定容,溶液過(guò)0.2 μm濾膜后,待上機(jī)測(cè)定。

    1.3.3 分析條件。

    1.3.3.1 色譜條件。色譜柱為HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm,Waters公司);流動(dòng)相 A為5 mmol/L乙酸銨-0.1%甲酸水溶液, B為甲醇溶液;柱溫40 ℃;進(jìn)樣量1.0 μL;洗脫程序見表1。

    1.3.3.2 質(zhì)譜條件。電噴霧ESI正離子模式;多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);離子源溫度150 ℃;毛細(xì)管電壓2.83 kV;脫溶劑溫度550 ℃;脫溶劑氣流量1 000 L/h;其他質(zhì)譜參數(shù)見表2。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

    鵝膏毒肽屬雙環(huán)八肽,鬼筆毒肽是一類環(huán)狀七肽,其支鏈上有較多的羥基和甲基,容易接受電子而被離子化,故常采用正離子模式進(jìn)行分析[6,12]。分別將6種毒肽的標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇稀釋成500 ng/mL,質(zhì)譜儀直接進(jìn)樣,在ESI正離子MS1Scan模式下,發(fā)現(xiàn)6種毒肽都有較強(qiáng)的M+1離子峰的出現(xiàn),因此選定M+1為母離子,在Daughter Scan模式下,分別找到每種毒肽的2個(gè)最佳子離子。最后優(yōu)化錐孔電壓、碰撞能、脫溶劑氣流量、脫溶劑氣溫度等質(zhì)譜參數(shù),使離子化效率更高、離子強(qiáng)度最大。具體6種毒肽的母離子和子離子見表2。

    2.2 色譜條件的優(yōu)化 試驗(yàn)選擇了UPLC HSS T3色譜柱(2.1 mm×100 mm,1.8 μm),此色譜柱是與100%水相相兼容的C18柱,對(duì)保留和分離極性有機(jī)小分子具有較為理想的效果。該試驗(yàn)選擇研究了4組流動(dòng)相(A組水-乙腈;B組水-甲醇;C組0.1%甲酸水-甲醇;D組5 mmol/L乙酸銨(0.1%甲酸)-甲醇)的分離效果,試驗(yàn)表明,甲醇的分離效果比乙腈好,且使用5 mmol/L乙酸銨(0.1%甲酸)作為水相時(shí),目標(biāo)物的離子峰強(qiáng)度較高,峰形較好。6種毒肽的標(biāo)準(zhǔn)提取離子圖詳見圖1。

    2.3 樣品前處理方法的優(yōu)化

    由于野生菌中成分復(fù)雜,脂肪、磷脂、肽類等雜質(zhì)含量較高,該試驗(yàn)采用了先溶劑提取、再固相萃取柱凈化的方法,先后比較了甲醇、水、乙腈3種溶劑的提取效果,結(jié)果表明,甲醇的提取效果較好,回收率高。

    試驗(yàn)考察了在使用HLB固相萃取柱凈化過(guò)程中,5%甲醇-氯仿和5%甲醇-水淋洗液的淋洗效果,結(jié)果表明,5%甲醇-氯仿淋洗液對(duì)HLB小柱中吸附的脂肪、磷脂等雜質(zhì)具有較好的洗脫效果,但回收率較差。綜合考慮,該試驗(yàn)采用5%甲醇-水作為淋洗液。

    2.4 線性范圍與檢出限 6種毒肽的線性方程、線性范圍和線性相關(guān)系數(shù)見表3。以3倍信噪比(S/N≥3)估算檢出限(LOD),6種毒肽的檢出限為30 μg/kg。

    2.5 方法回收率和精密度

    取1份樣品,分別對(duì)6種毒肽進(jìn)行低(50 μg/kg)、中(200 μg/kg)、高(600 μg/kg)濃度加標(biāo)試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表4),平均回收率分別為α-鵝膏毒肽99.5%~

    117.5%,β-鵝膏毒肽93.4%~107.0%,γ-鵝膏毒肽94.2%~110.1%,二羥鬼筆毒肽108.5%~119.8%,羧基二羥鬼筆毒肽 93.5%~109.7%,羧基三羥鬼筆毒肽93.1%~106.5%;6次平行測(cè)定,變異系數(shù)(CV)在1.49%~7.77%。

    2.6 野生菌樣品檢測(cè) 按上述方法對(duì)采集到的10個(gè)四川野生菌樣品進(jìn)行前處理和檢測(cè)。在4號(hào)和6號(hào)樣品中檢出了α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和二羥鬼筆毒肽3種毒蕈毒素,具體結(jié)果見表5,譜圖見圖2和圖3。

    3 結(jié)論

    該研究基于超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(UPLC-MS/MS),采用甲醇提取, HLB固相萃取柱凈化,HSS T3 色譜柱分離,電噴霧ESI正離子模式和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方

    式對(duì)6種毒蕈毒素的目標(biāo)離子進(jìn)行監(jiān)測(cè),外標(biāo)法定量,建立了6種毒蕈毒素的快速、準(zhǔn)確、選擇性好的測(cè)定方法。該方法與傳統(tǒng)的色譜法的檢測(cè)時(shí)間(20 min)相比,大大縮短了檢測(cè)時(shí)間,同時(shí)具備更高的準(zhǔn)確度、靈敏度和特異性,適用于野生菌中毒肽毒素的測(cè)定。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 魏佳會(huì),吳劍峰,陳佳,等.12種劇毒鵝膏菌的肽類毒素成分鑒定及其相對(duì)含量差異比較研究[J].分析化學(xué),2017,45(6):817-823.

    [2] 章鐵哲,孫承業(yè),李海蛟,等. 一起蘑菇致急性中毒事件的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查與鑒定[J].中華急診醫(yī)學(xué)雜志,2016,25(8):1012-1015.

    [3] 趙春艷,王婷婷,邰麗梅,等. 鵝膏菌肽類毒素的研究進(jìn)展[J].中國(guó)食用菌,2014,33(4):9-11,13.

    [4] 陳作紅,胡勁松,張志光,等. 我國(guó)28種鵝膏菌主要肽類毒素的檢測(cè)分析[J].菌物系統(tǒng),2003,22(4):565-573.

    [5] 杜秀菊,杜秀云.毒蕈毒素及其應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(13):7172-7174.

    [6] 劉陽(yáng),欒杰,林佶. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定云南野生致命鵝膏菌中的毒傘肽和毒肽毒素[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2017,8(10):3756-3761.

    [7] 柳潔,丁文婕,何碧英,等. 超高效液相色譜-電噴霧離子化-四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜指紋圖譜檢測(cè)毒蕈中4種鵝膏肽類毒素[J].分析化學(xué),2013,41(4):500-508.

    [8] 劉思潔,方赤光. 蕈菌毒素檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2017,8(3):754-760.

    [9] 包海鷹,圖力古爾,李玉.7種鵝膏菌屬真菌肽類毒素的HPLC分析(英文)[J].菌物研究,2005,3(1):13-16.

    [10] 周貽兵,李磊,吳玉田,等.超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定野生蘑菇中的3種鵝膏毒肽[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2018,45(22):4144-4147.

    [11] 雒婉霞,王冉冉,王慶國(guó),等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)毒蕈中5種鵝膏多肽類毒素[J].疾病預(yù)防控制通報(bào),2018,33(5):84-87.

    [12] 曹福祥,張志光,梁宋平.反相高效液相色譜法分離純化α-鵝膏毒肽[J].分析化學(xué),2003,31(5):562-565.

    猜你喜歡
    串聯(lián)質(zhì)譜法超高效液相色譜
    UPLC—MS/MS法測(cè)定雞蛋、雞肉中4種氟喹諾酮類藥物殘留
    水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物檢測(cè)結(jié)果不確定度的評(píng)定
    超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定豬尿液中30種不同種類“瘦肉精”藥物殘留
    氣相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定玩具產(chǎn)品中5種有機(jī)磷阻燃劑
    高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定益母草顆粒中鹽酸水蘇堿的含量
    醋酸艾司利卡西平片在比格犬體內(nèi)的相對(duì)生物利用度
    UPLC—MS/MS法同時(shí)測(cè)定葡萄中4種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑研究
    超高效液相色譜 串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定雞皮及脂肪組織中抗球蟲類藥物殘留
    食品罐內(nèi)壁涂料中雙酚 二縮水甘油醚的快速檢測(cè)和遷移規(guī)律
    超高效液相色譜 三重四極桿/復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜測(cè)定水樣中三苯甲烷類及代謝物
    国产一区有黄有色的免费视频| 久久这里有精品视频免费| 久久久久网色| 最近的中文字幕免费完整| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美av亚洲av综合av国产av | 久久久久久人人人人人| 99久久人妻综合| 国产免费又黄又爽又色| 国产欧美亚洲国产| 男女下面插进去视频免费观看| 婷婷色综合大香蕉| 成人漫画全彩无遮挡| 午夜老司机福利剧场| 亚洲精品第二区| 亚洲国产精品国产精品| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 男女免费视频国产| 五月伊人婷婷丁香| 久久久久久伊人网av| 电影成人av| 深夜精品福利| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 国产 精品1| 91精品伊人久久大香线蕉| 国产综合精华液| 看免费av毛片| 国产精品国产三级国产专区5o| 老熟女久久久| 在线天堂中文资源库| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 日本午夜av视频| 亚洲内射少妇av| 在线观看免费高清a一片| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产深夜福利视频在线观看| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 午夜日本视频在线| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 男男h啪啪无遮挡| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产国语露脸激情在线看| 一级毛片电影观看| a级毛片黄视频| 久久精品国产亚洲av天美| 亚洲,欧美精品.| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 日本wwww免费看| 在线观看国产h片| 2021少妇久久久久久久久久久| 国产精品蜜桃在线观看| 人妻一区二区av| 丝袜美腿诱惑在线| 男的添女的下面高潮视频| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产精品三级大全| a级毛片黄视频| av在线app专区| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 99精国产麻豆久久婷婷| 少妇被粗大猛烈的视频| xxxhd国产人妻xxx| 一区二区三区激情视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产男女超爽视频在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 日本爱情动作片www.在线观看| 国产精品免费视频内射| 秋霞伦理黄片| 高清黄色对白视频在线免费看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 咕卡用的链子| 亚洲精品一区蜜桃| 看免费成人av毛片| 亚洲美女视频黄频| 日韩欧美精品免费久久| 久久久国产精品麻豆| 国产成人精品久久久久久| 美女国产视频在线观看| 春色校园在线视频观看| 亚洲伊人色综图| 久久久久精品人妻al黑| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 欧美精品av麻豆av| 亚洲五月色婷婷综合| 久久久久久久亚洲中文字幕| 免费观看av网站的网址| 久久久久国产一级毛片高清牌| 美女福利国产在线| 欧美日韩亚洲高清精品| 国产欧美亚洲国产| 99久久中文字幕三级久久日本| 在线观看免费高清a一片| 999精品在线视频| 蜜桃在线观看..| 国产成人精品久久久久久| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 91在线精品国自产拍蜜月| 韩国av在线不卡| 亚洲三级黄色毛片| 老鸭窝网址在线观看| 一级毛片 在线播放| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 另类精品久久| 捣出白浆h1v1| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久热在线av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲av.av天堂| 国产男人的电影天堂91| 久久午夜福利片| 欧美亚洲日本最大视频资源| 高清视频免费观看一区二区| 最新的欧美精品一区二区| 男女国产视频网站| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 美女午夜性视频免费| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 亚洲国产欧美在线一区| 老司机亚洲免费影院| 伊人久久国产一区二区| 免费观看在线日韩| 亚洲精品国产一区二区精华液| av不卡在线播放| 97在线人人人人妻| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 性少妇av在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 美女高潮到喷水免费观看| 日本午夜av视频| 亚洲精品久久午夜乱码| 九九爱精品视频在线观看| 在线精品无人区一区二区三| 在线看a的网站| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产日韩欧美在线精品| 天天影视国产精品| 涩涩av久久男人的天堂| 天天影视国产精品| 亚洲男人天堂网一区| 美女高潮到喷水免费观看| 免费观看在线日韩| 国产高清不卡午夜福利| 欧美精品一区二区大全| 亚洲精品,欧美精品| 国产麻豆69| 美女主播在线视频| av免费在线看不卡| 99久国产av精品国产电影| 涩涩av久久男人的天堂| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 欧美精品国产亚洲| 国产乱来视频区| 欧美人与善性xxx| 久久99蜜桃精品久久| 久久ye,这里只有精品| 只有这里有精品99| 两个人看的免费小视频| 久久久久久久国产电影| 90打野战视频偷拍视频| 亚洲国产欧美在线一区| 日本免费在线观看一区| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 午夜激情av网站| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩成人av中文字幕在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 成人亚洲欧美一区二区av| 日本vs欧美在线观看视频| 午夜老司机福利剧场| videos熟女内射| 国产有黄有色有爽视频| 国产精品欧美亚洲77777| 9热在线视频观看99| 宅男免费午夜| 亚洲av成人精品一二三区| 国产成人a∨麻豆精品| 乱人伦中国视频| 久久国产精品大桥未久av| 女人精品久久久久毛片| 不卡av一区二区三区| 青春草视频在线免费观看| 国产伦理片在线播放av一区| 久久精品亚洲av国产电影网| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 乱人伦中国视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| www.精华液| 韩国av在线不卡| 99国产精品免费福利视频| 99热国产这里只有精品6| 黄色毛片三级朝国网站| 久久久久久人妻| 国产免费现黄频在线看| 精品久久久久久电影网| 在线 av 中文字幕| 欧美激情 高清一区二区三区| 黄片无遮挡物在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 又大又黄又爽视频免费| 久久热在线av| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 岛国毛片在线播放| 成人国产麻豆网| 婷婷色综合www| 在线观看一区二区三区激情| 欧美日韩成人在线一区二区| 黄色怎么调成土黄色| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲av日韩在线播放| 丰满乱子伦码专区| 免费看av在线观看网站| 大香蕉久久网| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| www.熟女人妻精品国产| av不卡在线播放| 国产精品蜜桃在线观看| 中文字幕人妻丝袜一区二区 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 国产精品久久久久久av不卡| 免费看不卡的av| 精品一区二区免费观看| 99热全是精品| 最近中文字幕2019免费版| www.熟女人妻精品国产| 久久久国产欧美日韩av| 久久久久精品久久久久真实原创| 少妇 在线观看| 成年人免费黄色播放视频| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 久久久国产精品麻豆| 桃花免费在线播放| 久久久久精品性色| www.av在线官网国产| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 久久人人爽人人片av| 久久久欧美国产精品| 91国产中文字幕| 国产高清国产精品国产三级| 国产精品蜜桃在线观看| 日韩人妻精品一区2区三区| 天美传媒精品一区二区| 国产日韩欧美在线精品| 久久99精品国语久久久| 亚洲色图综合在线观看| 男女无遮挡免费网站观看| 欧美日韩成人在线一区二区| 午夜福利影视在线免费观看| 18禁动态无遮挡网站| 一级爰片在线观看| 午夜免费观看性视频| 五月开心婷婷网| 亚洲av国产av综合av卡| 精品少妇内射三级| 亚洲视频免费观看视频| 美女国产视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 免费高清在线观看日韩| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 香蕉精品网在线| 欧美最新免费一区二区三区| 国产视频首页在线观看| 熟妇人妻不卡中文字幕| 这个男人来自地球电影免费观看 | 婷婷色麻豆天堂久久| 一区二区三区乱码不卡18| 人妻 亚洲 视频| 日韩中字成人| 欧美日韩精品网址| 亚洲经典国产精华液单| 国产男女内射视频| 女性被躁到高潮视频| 国产免费现黄频在线看| 亚洲情色 制服丝袜| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av欧美aⅴ国产| 黄色怎么调成土黄色| 少妇精品久久久久久久| 国产一区二区三区av在线| 日韩欧美精品免费久久| 在线精品无人区一区二区三| 国产男人的电影天堂91| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 91精品三级在线观看| 亚洲成国产人片在线观看| 免费黄色在线免费观看| 国产男女超爽视频在线观看| 男女高潮啪啪啪动态图| 老熟女久久久| 91国产中文字幕| 午夜福利影视在线免费观看| 欧美日本中文国产一区发布| 有码 亚洲区| 丰满饥渴人妻一区二区三| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 久久久久久伊人网av| 精品少妇一区二区三区视频日本电影 | 国产精品三级大全| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 精品福利永久在线观看| 黑人欧美特级aaaaaa片| 国产成人精品一,二区| 国产黄频视频在线观看| 咕卡用的链子| 免费大片黄手机在线观看| 久久这里只有精品19| 国产一区二区 视频在线| 欧美成人午夜免费资源| 美女大奶头黄色视频| 亚洲精品久久午夜乱码| av视频免费观看在线观看| 欧美bdsm另类| 国产乱来视频区| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 精品第一国产精品| 青春草视频在线免费观看| 久久久久精品久久久久真实原创| 免费黄色在线免费观看| 老司机影院毛片| 搡老乐熟女国产| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 哪个播放器可以免费观看大片| av女优亚洲男人天堂| 伦理电影大哥的女人| 国产精品欧美亚洲77777| 亚洲美女搞黄在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 成人午夜精彩视频在线观看| xxx大片免费视频| 超碰97精品在线观看| av.在线天堂| 综合色丁香网| 亚洲三级黄色毛片| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 亚洲五月色婷婷综合| 成年美女黄网站色视频大全免费| 色视频在线一区二区三区| 美女午夜性视频免费| 欧美日韩精品成人综合77777| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲,欧美精品.| xxx大片免费视频| 三上悠亚av全集在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲国产最新在线播放| 欧美黄色片欧美黄色片| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产爽快片一区二区三区| 亚洲av欧美aⅴ国产| 免费观看性生交大片5| 18禁动态无遮挡网站| 精品人妻在线不人妻| 一边摸一边做爽爽视频免费| 一级爰片在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 极品少妇高潮喷水抽搐| 国产免费现黄频在线看| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 97在线视频观看| 另类精品久久| 亚洲在久久综合| 最黄视频免费看| 亚洲欧美清纯卡通| 精品视频人人做人人爽| 电影成人av| 人人澡人人妻人| 成人二区视频| 亚洲男人天堂网一区| 中文欧美无线码| 日本爱情动作片www.在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 少妇人妻久久综合中文| 性色av一级| 精品酒店卫生间| 欧美少妇被猛烈插入视频| 涩涩av久久男人的天堂| 一区二区av电影网| 国产一级毛片在线| 久久免费观看电影| 精品国产国语对白av| 国产伦理片在线播放av一区| 男女国产视频网站| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲国产av影院在线观看| 另类精品久久| 国产精品国产三级专区第一集| 女性被躁到高潮视频| 久久久国产精品麻豆| √禁漫天堂资源中文www| 成人二区视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 午夜日韩欧美国产| 亚洲在久久综合| 久久ye,这里只有精品| 精品一区二区三卡| 色婷婷av一区二区三区视频| 高清欧美精品videossex| 老熟女久久久| 女性被躁到高潮视频| 亚洲国产看品久久| 亚洲欧美精品自产自拍| 97在线人人人人妻| 欧美精品国产亚洲| 一本久久精品| 天天影视国产精品| 久久av网站| 两性夫妻黄色片| 综合色丁香网| 韩国精品一区二区三区| 国产高清不卡午夜福利| 中国三级夫妇交换| 成年人午夜在线观看视频| 久久久欧美国产精品| 日韩一本色道免费dvd| 精品午夜福利在线看| 一二三四在线观看免费中文在| 国产午夜精品一二区理论片| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 成人国语在线视频| 9191精品国产免费久久| 亚洲少妇的诱惑av| 久久人妻熟女aⅴ| 午夜激情久久久久久久| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 少妇的逼水好多| freevideosex欧美| 亚洲欧洲日产国产| 少妇人妻精品综合一区二区| 宅男免费午夜| 美女主播在线视频| 超碰成人久久| 久久久久国产网址| 99久久中文字幕三级久久日本| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| av在线app专区| 永久免费av网站大全| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 午夜精品国产一区二区电影| 不卡视频在线观看欧美| 欧美bdsm另类| 精品少妇内射三级| 国产野战对白在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 日韩成人av中文字幕在线观看| 免费看av在线观看网站| 大香蕉久久网| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品国产综合久久久| 精品视频人人做人人爽| 久久女婷五月综合色啪小说| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 国产精品亚洲av一区麻豆 | av卡一久久| 午夜老司机福利剧场| 欧美av亚洲av综合av国产av | 看免费成人av毛片| 七月丁香在线播放| 亚洲av免费高清在线观看| 18禁国产床啪视频网站| 日本av免费视频播放| 最近中文字幕高清免费大全6| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 亚洲欧美精品自产自拍| 男女国产视频网站| 男人舔女人的私密视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 国产精品欧美亚洲77777| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲成色77777| 日韩av免费高清视频| 亚洲av综合色区一区| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 五月开心婷婷网| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 亚洲精品成人av观看孕妇| 大香蕉久久网| av又黄又爽大尺度在线免费看| 性色av一级| 人体艺术视频欧美日本| 搡老乐熟女国产| 国产精品久久久久久精品古装| 捣出白浆h1v1| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 制服丝袜香蕉在线| 两个人看的免费小视频| 久久久久久久大尺度免费视频| 国产av码专区亚洲av| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美成人午夜精品| 女人久久www免费人成看片| 可以免费在线观看a视频的电影网站 | 26uuu在线亚洲综合色| av电影中文网址| 熟女av电影| 精品一区二区免费观看| 国产精品免费视频内射| videosex国产| 亚洲内射少妇av| 18禁动态无遮挡网站| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 9色porny在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 在线观看国产h片| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久韩国三级中文字幕| 午夜免费男女啪啪视频观看| av免费观看日本| 国产成人a∨麻豆精品| 欧美精品高潮呻吟av久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品少妇内射三级| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲精品第二区| 久久99一区二区三区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 久热这里只有精品99| 视频区图区小说| 曰老女人黄片| 色网站视频免费| 久久热在线av| 天天影视国产精品| 日本色播在线视频| 欧美日韩精品网址| 黄色配什么色好看| 多毛熟女@视频| 午夜福利视频在线观看免费| 一区二区三区精品91| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产在线免费精品| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 性色av一级| 亚洲一码二码三码区别大吗| 久久久久视频综合| 飞空精品影院首页| 1024视频免费在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 国产一区二区激情短视频 | 一级毛片 在线播放| 妹子高潮喷水视频| 国产一区二区三区av在线| 人妻少妇偷人精品九色| 大陆偷拍与自拍| 国产一区二区 视频在线| 国产一区有黄有色的免费视频| 一区二区三区精品91| 丝袜脚勾引网站| 黄频高清免费视频| 精品一区在线观看国产| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久99蜜桃精品久久| 国产精品熟女久久久久浪| 成年人免费黄色播放视频| 97在线视频观看| 在线观看一区二区三区激情| 人人妻人人澡人人看| 久久精品久久久久久久性| 成人毛片60女人毛片免费| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 日本黄色日本黄色录像| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产成人午夜福利电影在线观看| www.精华液| 精品一区二区三卡| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品一区蜜桃| 日韩精品有码人妻一区| 国产精品久久久久久精品古装| 两性夫妻黄色片| 在线免费观看不下载黄p国产| 满18在线观看网站| 国产精品嫩草影院av在线观看| 天堂中文最新版在线下载| 国产成人精品久久二区二区91 | 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美日韩av久久| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 免费观看在线日韩| www日本在线高清视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 夫妻性生交免费视频一级片| 久久午夜福利片| 国产一区二区三区综合在线观看| 青青草视频在线视频观看| 久久鲁丝午夜福利片| 热re99久久国产66热| 国产男女超爽视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 久久久久国产网址| 一二三四中文在线观看免费高清| 久久精品国产亚洲av涩爱| 久久青草综合色| 在线精品无人区一区二区三| 日本爱情动作片www.在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 欧美人与性动交α欧美精品济南到 | 波多野结衣一区麻豆| 下体分泌物呈黄色| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久 成人 亚洲| 亚洲经典国产精华液单| 日韩欧美精品免费久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 丰满迷人的少妇在线观看| av线在线观看网站|