細(xì)胞自噬與凋亡相互作用分子機(jī)制的研究進(jìn)展

張 楊，孫彎彎，陸麗丹，馮曉玲*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 婦科， 黑龍江 哈爾濱 150036； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)， 黑龍江 哈爾濱 150040；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)常熟附屬醫(yī)院， 江蘇 常熟 215500)

1 自噬的分類及過程(圖1)

自噬(autophagy)是真核細(xì)胞所特有的現(xiàn)象。廣義的自噬包括4種形式：微自噬，分子伴侶介導(dǎo)的自噬、非典型自噬及巨自噬，本文主要論述巨自噬。

在哺乳動(dòng)物中經(jīng)典自噬途徑有5個(gè)階段，即啟動(dòng)、成核、伸長(zhǎng)、溶酶體融合以及自噬體內(nèi)容物的降解。自噬的啟動(dòng)開始于unc-51樣自噬激活激酶1(unc-51 like autophagy activating kinase，ULK1)激酶復(fù)合物的激活。ULK1作為一種細(xì)胞質(zhì)激酶，是自噬相關(guān)基因1(autophagy-related gene1，Atg1)在哺乳動(dòng)物中的同源蛋白，它與黏著斑激酶家族相互作用蛋白(FAK family-interacting protein of 200 ku，F(xiàn)IP200)、自噬相關(guān)基因Atg13和Atg101相互作用形成ULK1復(fù)合物[1]。哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)的抑制和/或腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK)的活化直接調(diào)控ULK1復(fù)合物的活性[1]。ULK1活化促進(jìn)具有Ⅲ類磷脂酰肌醇3-激酶(class Ⅲ phosphoinositide 3-kinase，PI3K-Ⅲ又稱PIK3C3)活性的多蛋白復(fù)合物的募集。Beclin-1是ULK1的下游直接靶點(diǎn)，它調(diào)節(jié)PI3K-Ⅲ催化單元空泡分選蛋白34(vacuolar protein sorting34，Vps34)的脂質(zhì)激酶活性，Vps34產(chǎn)生磷脂酰肌醇3-磷酸[phosphatidylinositol 3-phosphate，PI(3)P]，使許多參與自噬體成核的自噬蛋白得以募集，從而形成Vps34-Vps15-Beclin-1復(fù)合物。當(dāng)自噬被誘導(dǎo)發(fā)生時(shí)，Vps34-Vps15-Beclin-1能夠和多種自噬相關(guān)蛋白結(jié)合，傳遞自噬信號(hào)并促進(jìn)自噬的發(fā)生[2]。成核階段，細(xì)胞器的雙層膜結(jié)構(gòu)在待降解物質(zhì)周圍包繞形成分隔膜。其間，p62作為自噬銜接蛋白，將功能失調(diào)和過剩的線粒體帶到自噬體，隨后通過結(jié)合微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(protein light chain3，LC3)將這些線粒體困在自噬體中。分隔膜繼續(xù)彎曲伸長(zhǎng)，并完全包繞細(xì)胞質(zhì)，形成完整的雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體。自噬體與胞內(nèi)體融合形成自噬內(nèi)涵體，然后再與溶酶體融合，形成自噬溶酶體，或者自噬體直接與溶酶體融合形成自噬溶酶體。

2 凋亡的分類及過程(圖1)

圖1 自噬和凋亡過程Fig 1 Process of autophagy and apoptosis

凋亡(apoptosis)也是細(xì)胞程序性死亡的一種類型。凋亡過程分為外源性途徑和內(nèi)源性途徑[3]。外源性凋亡途徑又稱為死亡受體途徑，因細(xì)胞外微環(huán)境的改變而觸發(fā)，當(dāng)細(xì)胞外死亡配體激活質(zhì)膜上的死亡受體，外源性凋亡便啟動(dòng)。其過程依賴死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物(death-inducing signalling complex，DISC)的形成，DISC中激活的半胱氨酸蛋白酶caspase-8和10通過caspase-3的裂解觸發(fā)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終通過切割多種細(xì)胞靶標(biāo)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。內(nèi)源性和外源性途徑均導(dǎo)致caspase-3激活[4]。內(nèi)源性途徑又稱為線粒體途徑，其關(guān)鍵步驟是線粒體外膜通透化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)，這個(gè)過程能夠從線粒體膜間空間釋放促凋亡因子，如細(xì)胞色素C。細(xì)胞色素C被釋放到胞質(zhì)溶膠中，與凋亡肽酶激活因子-1(apoptotic protease activating factor-1， Apaf-1)及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)[5]結(jié)合，推動(dòng)形成一種稱為“凋亡體”的蛋白質(zhì)復(fù)合物，該復(fù)合物誘導(dǎo)caspase-9的活化。Caspase-9的活化激活caspase-3及caspase-7，最終導(dǎo)致細(xì)胞因被caspase切割而亡。

3 自噬與凋亡的相互關(guān)系

細(xì)胞自噬和凋亡的關(guān)系是錯(cuò)綜復(fù)雜的，在病毒感染、饑餓等應(yīng)激條件下，細(xì)胞自噬被誘導(dǎo)發(fā)生，而持續(xù)應(yīng)激時(shí)，細(xì)胞凋亡則被激活，兩者之間的轉(zhuǎn)換條件和機(jī)制仍在不斷探索中，而自噬和凋亡過程中涉及的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的雙重調(diào)節(jié)作用成為近年來研究?jī)烧哧P(guān)系的重點(diǎn)。

3.1 自噬調(diào)節(jié)凋亡

自噬可以抑制或增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，或誘導(dǎo)獨(dú)立于凋亡的細(xì)胞死亡，這取決于細(xì)胞類型、刺激的類型和持續(xù)時(shí)間[6]。自噬體形成過程中，自噬蛋白ATG12和ATG5在泛素化樣過程中共價(jià)結(jié)合，但最近發(fā)現(xiàn)，即使沒有ATG結(jié)合系統(tǒng)，也可以形成自噬體，盡管速率降低[7]。另外，ATG5和ATG12在不同應(yīng)激信號(hào)引起的細(xì)胞凋亡中也起著關(guān)鍵作用，ATG12和ATG5的非結(jié)合形式有助于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在凋亡細(xì)胞中，ATG5被鈣蛋白酶切割，導(dǎo)致其N-端片段轉(zhuǎn)移到線粒體，并在線粒體中，通過與促生存的B細(xì)胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)家族成員特大B細(xì)胞淋巴瘤(B cell lymph-oma extra large，Bcl-xL)相互作用，介導(dǎo)細(xì)胞色素C的釋放[8]。非共軛型ATG12可結(jié)合Bcl-2家族蛋白，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。

前面提到，Beclin-1是自噬體形成過程不可或缺的調(diào)節(jié)蛋白，同時(shí)，它也對(duì)凋亡起著調(diào)控作用。Beclin-1是Bcl-2家族中的BH3-only蛋白。定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Bcl-2通常與Beclin-1通過Beclin-1的BH3結(jié)構(gòu)域持續(xù)結(jié)合，從而抑制自噬的發(fā)生。Beclin-1被caspase裂解而失去誘導(dǎo)自噬的能力，目前已知caspase-3、-6、-7、-8、-9和-10可以對(duì)Beclin-1進(jìn)行剪切[10]。之后，其C-末端片段易位至線粒體，并在體外滲透分離的線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放，從而使細(xì)胞對(duì)細(xì)胞凋亡敏感。因而，Beclin-1對(duì)細(xì)胞凋亡和自噬起著雙重調(diào)控作用。

而caspases的激活依賴自噬體的形成，并參與自噬的調(diào)節(jié)[10]，它還可以通過裂解細(xì)胞中的功能蛋白致使細(xì)胞凋亡[11]。Caspases被招募到自噬體中，而自噬體作為細(xì)胞內(nèi)激活它們的平臺(tái)。在被招募到自噬體的過程中，泛素化caspase-8通過p62的泛素結(jié)合域UBD與p62結(jié)合，隨后p62和LC3直接相互作用從而被招募到自噬體。重要的是，p62不僅可以將caspase-8招募到自噬體中，還能夠激活caspase-8。而p62介導(dǎo)的線粒體聚類破壞是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡加劇的原因[12]。

另外，細(xì)胞凋亡受自噬降解過程的影響，干擾自噬體的形成或溶酶體的活動(dòng)都可能影響凋亡過程，比如自噬清除受損的線粒體從而增加細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)的閾值[13]，又如，caspase-8被招募到自噬體中，還主要參與了腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，因而通過降解活化的caspase-8可以限制細(xì)胞凋亡。另外，CMA可通過降解肝細(xì)胞內(nèi)脂滴(lipid drople，LD)相關(guān)脂滴包被蛋白2(perilipin2，PLIN2)調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解從而改善足細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)集聚和凋亡[14]。總而言之，自噬對(duì)凋亡的調(diào)節(jié)主要是通過自噬過程中相關(guān)蛋白與凋亡蛋白之間相互作用來實(shí)現(xiàn)的。

3.2 凋亡調(diào)節(jié)自噬

凋亡機(jī)制的組成部分可以通過與自噬蛋白相互作用直接影響自噬。破壞凋亡蛋白Bcl-2與Beclin-1的復(fù)合物可以增加哺乳動(dòng)物自噬，如截?cái)嗟腂H3相互作用域死亡激動(dòng)劑(truncated-BH3-interacting domain death agonist，tBID)、Bcl-2細(xì)胞死亡拮抗劑(Bcl-2 antagonist of cell death，BAD)和Bcl-2與腺病毒E1B 19 ku蛋白相互作用蛋白3(Bcl-2 and adenovirus E1B 19 ku protein-interacting protein 3，BNIP3)等其他Bcl-2家族蛋白能夠競(jìng)爭(zhēng)性置換Beclin-1 BH3結(jié)構(gòu)域[13]，從而增加自噬。另外，Bcl-2和Beclin-1的磷酸化也是導(dǎo)致兩者解離的重要因素[13]。

細(xì)胞死亡的Bcl-2相互作用介質(zhì)(Bcl-2-interacting mediator of cell death，BIM)是Bcl-2家族中的一種僅有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族蛋白(the Bcl-2 homology domain 3-only，BH3-only)，具有促凋亡作用。另外，BIM被證明是自噬的抑制劑，在靜息細(xì)胞中，BIM通過與自噬調(diào)節(jié)因子Beclin-1相互作用抑制自噬[6]。

FADD樣白細(xì)胞介素β轉(zhuǎn)換酶(FADD-like interleukin beta-converting enzyme，F(xiàn)LICE)樣抑制物蛋白(FLICE like inhibitor protein，F(xiàn)lip)是一種抗凋亡蛋白，參與抑制死亡受體介導(dǎo)的凋亡。FlipS和FlipL是Flip的兩個(gè)亞型，F(xiàn)lipS通過抑制caspase-8絲狀體的形成來抑制細(xì)胞凋亡。FlipL通過抑制caspase-8的成熟和釋放抑制細(xì)胞凋亡[15]。但當(dāng)Flip水平較低時(shí)，caspase-8同源二聚化并通過蛋白裂解激活自身，導(dǎo)致活化的caspase-8釋放并啟動(dòng)凋亡。另外，F(xiàn)lip蛋白內(nèi)的不同區(qū)域控制其抗自噬和抗凋亡活性，可同時(shí)抑制自噬和凋亡。FlipL通過與LC3競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合ATG3來抑制自噬[16]，除了這種自噬的直接調(diào)節(jié)外，F(xiàn)lipL還通過與前caspase-10的相互作用影響自噬[17]。

p53是一種凋亡調(diào)節(jié)因子，可通過兩種機(jī)制誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，首先，p53作為轉(zhuǎn)錄因子分別誘導(dǎo)和抑制促凋亡靶基因和抗凋亡靶基因。其次，p53能夠轉(zhuǎn)移到線粒體，與Bcl-2家族成員相互作用，誘導(dǎo)線粒體膜通透化和細(xì)胞色素C的釋放[18]。P53通常存在于胞質(zhì)中，可在DNA損傷后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[19]，現(xiàn)有證據(jù)表明[20]，核p53是一種促自噬因子，它通過轉(zhuǎn)錄依賴的方式調(diào)控mTOR通路來誘導(dǎo)自噬。但在細(xì)胞質(zhì)中，p53卻抑制自噬的誘導(dǎo)，胞質(zhì)中的p53通過與FIP200相互作用來抑制自噬，從而阻止ULK1-FIP200-ATG13-ATG101復(fù)合物的激活并抑制自噬體的形成[21]。

4 問題與展望

綜上所述，細(xì)胞的自噬與凋亡是兩個(gè)密切相關(guān)的復(fù)雜過程，自噬和凋亡過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白能夠通過直接或間接作用而達(dá)到對(duì)自噬和凋亡的雙重調(diào)節(jié)，但是兩者之間互相轉(zhuǎn)換的機(jī)制以及相關(guān)調(diào)節(jié)蛋白對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的影響仍需要進(jìn)一步明確。近年來，越來越多的文獻(xiàn)研究?jī)烧咴谝种苹虼龠M(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖過程中的作用，因此，更好的了解細(xì)胞自噬和凋亡將對(duì)疾病的認(rèn)識(shí)和治療至關(guān)重要。