N-乙酰半胱氨酸對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠治療作用及機(jī)制

楊 珺，潘獻(xiàn)柱，汪曉慶，謝琳琳，劉梅梅，趙大海，葉 靜，汪陶榮，陳曉宇

（1. 安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230061；2. 安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 合肥 230601；3.安徽醫(yī)科大學(xué)形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，安徽 合肥 230032）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）病因未明，常表現(xiàn)為多發(fā)性小關(guān)節(jié)對稱性炎癥，往往以體液免疫為主，病變部位有大量炎細(xì)胞浸潤，病變遷延會導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能障礙、殘疾［1］。Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）是高度保守的模式識別受體因子（pattern recognition receptor factors，PRRs）家族中的跨膜受體，激活后能進(jìn)行炎癥反應(yīng)［2］。Toll 樣 受 體2（Toll-like receptor 2，TLR2）是重要的TLRs，通過識別細(xì)菌脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，募集下游炎癥細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白 細(xì) 胞 介 素-1β（interleukin 1β，IL-1β）、白細(xì)胞介素-10（interleukin 10，IL-10）等致炎細(xì)胞因子升高，引起機(jī)體自身免疫性炎癥［3］。同時(shí)，長期慢性炎癥使得RA 患者活動期機(jī)體活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）升高，抗氧化物酶水平下降［4］。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）是含有巰基的半胱氨酸衍生物，可降解酸性肽鏈中的二硫鍵［5］。炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相互作用可能為RA 發(fā)病的重要機(jī)制［6］，但兩者關(guān)聯(lián)性需進(jìn)一步確認(rèn)。NAC 的抗氧化作用，清除機(jī)體ROS，能否降低RA 的慢性炎癥反應(yīng)，值得進(jìn)一步研究。佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）是常用RA 動物模型［7］，本文旨在研究NAC 對AA大鼠的抗炎作用，并觀察TLR2 和下游炎癥因子途徑在其中的可能作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

足跖容積測量儀（YLS-7C 型），北京凱輝盛達(dá)科技發(fā)展有限公司；激光共聚焦顯微鏡（LEXT OLS4100 型），日本奧林巴斯公司；全自動酶標(biāo)儀（infnite 200 PRO），瑞士帝肯公司。NAC，美國Swanson 公司；弗氏完全佐劑（freund's complete adjuvant，F(xiàn)CA），武漢易泰科技有限公司；兔抗鼠TLR2 單克隆抗體，荷蘭Hycult Biotech 公司；兔抗鼠β-actin 多克隆抗體，美國Abbkine 公司；ELISA 試劑盒TNF-α、IL-1β、IL-10，美國Biovision 公司；羊抗兔二抗和顯色試劑盒，武漢博士德生物有限公司；蛋白測定和化學(xué)發(fā)光試劑盒，美國Absin Bioscience有限公司。

1.2 動物分組與給藥

50 只健康雄性sprague-dawley（SD）大鼠，體質(zhì)量（210±10）g，購于安徽省動物實(shí)驗(yàn)中心（皖準(zhǔn)字2019-01）。SD 大鼠飼養(yǎng)于（25±2）℃環(huán)境中，白天夜晚12 h 光照交替。造模和給藥參照文獻(xiàn)［8］，50只動物隨機(jī)分成兩組：對照組10 只0.1 mL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）注射右后足趾皮下；另40 只造模，構(gòu)建AA 大鼠，右后足趾皮下注射0.1 mL FCA，致炎10 d 后，再分成4 組，每組10只：模型組及NAC 低、中、高劑量組（灌胃給藥量50、100、200 mg/kg），NAC 連續(xù)灌胃16 d，對照組與模型組灌胃等量PBS。本實(shí)驗(yàn)符合學(xué)校實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會規(guī)定。

1.3 關(guān)節(jié)炎癥狀判定和標(biāo)本處理

關(guān)節(jié)炎癥指標(biāo)參照文獻(xiàn)［8］，造模后10 d 開始，每4 天記錄一次關(guān)節(jié)病變。（1）關(guān)節(jié)腫脹度：反映繼發(fā)性炎癥改變，應(yīng)用容積測量儀測量SD 大鼠左后肢踝關(guān)節(jié)以下的容積變化（ΔmL）=致炎后左后肢容積（mL）-致炎前左后肢容積（第10 天，mL）。（2）關(guān)節(jié)炎指數(shù)：反映四肢炎性改變，最高12 分，標(biāo)準(zhǔn)如下，0 分：四肢關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)無變化；1 分：某個(gè)四肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑或輕微腫脹；2 分：≥2 個(gè)四肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和輕微腫脹；3 分：≥2 個(gè)四肢關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅斑和腫脹；4 分：≥2 個(gè)四肢關(guān)節(jié)腫脹明顯，不能站立。第26天，戊巴比妥鈉麻醉下，股靜脈取血、離心，-20 ℃保存待測炎癥因子；每組隨機(jī)選取3 只SD 大鼠左后肢踝關(guān)節(jié)，做組織學(xué)檢查；每組余下7 只SD 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織，以踝關(guān)節(jié)為中心，逐層切開，剝?nèi)￡P(guān)節(jié)面上方呈淡黃色的滑膜組織，-80 ℃凍存作進(jìn)一步研究。

1.4 踝關(guān)節(jié)免疫組織化學(xué)檢查

做組織學(xué)檢查的SD 大鼠踝關(guān)節(jié)固定于4%多聚甲醛溶液中，硝酸脫鈣、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋、厚3 μm 切片，免疫組化采取鏈霉素過氧化合物酶復(fù)合物（strept actividin-biotin complex，SABC）法，根據(jù)試劑盒說明書，切片脫蠟至水，經(jīng)過3%H2O2處理、抗原修復(fù)、封閉抗原，滴加一抗兔抗鼠TLR2 單克隆抗體（濃度1∶200）50 μL，4 ℃孵育過夜，次日二抗、SABC 染液50 μL、DAB 顯色、蘇木精復(fù)染，再行脫水、透明、封片、鏡檢、攝片。免疫組化染色判斷，陽性結(jié)果為細(xì)胞質(zhì)（或核）呈黃色或棕黃色，采用PBS 替代一抗作陰性對照。采用南京捷達(dá)JD801 圖像分析軟件，參照文獻(xiàn)［9］計(jì)算TLR2 免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞光密度值（optical density，OD）。

1.5 Western blot 法測定TLR2 蛋白表達(dá)

取出踝關(guān)節(jié)滑膜組織后，加入組織裂解液，將滑膜組織研磨成勻漿，離心后，測定組織總蛋白含量。上樣30 μg 蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，電轉(zhuǎn)移法將蛋白至硝酸纖維素膜，孵育一抗：兔抗鼠TLR2 單克隆抗體（濃度1∶1 500），兔抗鼠β-actin 多克隆抗體（濃度1∶3 000），化學(xué)發(fā)光法顯像，Image J 軟件作半定量分析。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）測定血清炎癥因子濃度

SD 大鼠血清炎癥因子含量檢測采取ELISA法，按照美國Biovision 公司提供的ELISA 試劑盒說明書步驟，檢測血清TNF-α、IL-1β、IL-10 濃度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件包，關(guān)節(jié)炎指數(shù)、關(guān)節(jié)腫脹度、TLR2 蛋白和炎癥因子含量等計(jì)量資料以（±s）表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后采用t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAC 對AA 大鼠繼發(fā)性關(guān)節(jié)腫脹的影響

為觀察NAC 改善SD 大鼠非炎癥側(cè)關(guān)節(jié)腫脹情況，應(yīng)用排水法計(jì)算從FCA 注射第10 天開始，連續(xù)16 d。與對照組SD 大鼠比較，AA 模型組繼發(fā)性足腫脹明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；NAC低、中、高劑量組灌胃給藥后，明顯抑制AA 模型大鼠的繼發(fā)性足腫脹（P＜0.05 或P＜0.01），NAC 高劑量組變化最明顯，見表1。

表1 各組足腫脹度（ΔmL）比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of secondary lateral joint swelling（ΔmL）of rats in the each group（n=10，±s）

表1 各組足腫脹度（ΔmL）比較（n=10，±s）Tab 1 Comparison of secondary lateral joint swelling（ΔmL）of rats in the each group（n=10，±s）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

26 d 0.23±0.03 0.82±0.07##0.73±0.08*0.54±0.04**0.44±0.05**組別對照組模型組NAC 低劑量組NAC 中劑量組NAC 高劑量組10 d 0.10±0.02 0.43±0.05##0.44±0.04 0.44±0.04 0.45±0.03 14 d 0.12±0.03 0.54±0.05##0.51±0.04 0.49±0.04*0.47±0.05*18 d 0.17±0.02 0.71±0.05##0.64±0.06*0.54±0.04**0.48±0.05**22 d 0.20±0.03 0.88±0.06##0.81±0.06*0.71±0.05**0.54±0.04**

2.2 NAC 對大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)癥的影響

致炎10 d 后，與對照組SD 大鼠相比較，AA 模型組大鼠非致炎側(cè)（左后肢）足趾開始腫脹，進(jìn)行性加重，直至站立困難，各時(shí)間點(diǎn)關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；NAC 低、中、高劑量組各治療組均有效緩解癥狀，關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），以NAC 高劑量組最為明顯，見表2。

表2 各組繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（n=10，±s）Tab 2 Comparison of secondary arthritis index of rats in each group（n=10，±s）

表2 各組繼發(fā)性關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較（n=10，±s）Tab 2 Comparison of secondary arthritis index of rats in each group（n=10，±s）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

26 d 0.95±0.40 8.71±0.61##5.56±0.46**4.23±0.47**3.72±0.37**組別對照組模型組NAC 低劑量組NAC 中劑量組NAC 高劑量組10 d 0.56±0.25 5.91±0.45##5.71±0.39 5.61±0.42 5.82±0.39 14 d 0.76±0.29 6.80±0.63##6.12±0.56*5.97±0.65*5.58±0.47**18 d 0.92±0.27 8.60±0.68##6.39±0.71**6.19±0.68**5.74±0.52**22 d 0.98±0.31 9.52±0.72##6.87±0.68**5.43±0.52**5.06±0.48**

2.3 免疫組化染色顯示NAC 對AA 大鼠踝關(guān)節(jié)TLR2 蛋白表達(dá)

陽性染色呈黃色或棕黃色顆粒，位于關(guān)節(jié)滑膜和軟骨細(xì)胞中。對照組SD 大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織中有少量TLR2 蛋白陽性表達(dá)；AA 模型大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織增厚，TLR2 蛋白表達(dá)增加；NAC 治療組隨著灌胃劑量的增加，TLR2 蛋白陽性表達(dá)逐漸減弱，見圖1。計(jì)算TLR2 蛋白陽性O(shè)D 值，與對照組OD 值（0.13±0.02）比較，AA 模型組OD 值（0.39±0.09）明顯升高（t=6.733，P＜0.01），NAC 低、中、高劑量組TLR2 蛋白的OD 值均降低，分別為（0.31±0.07）、（0.26±0.06）、（0.21±0.05），與模型組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。

圖1 各組踝關(guān)節(jié)TLR2 蛋白表達(dá)免疫組化結(jié)果（SABC 染色×100）Fig 1 Immunohistochemical results of TLR2 protein expression in ankle joints of rats（SABC staining ×100）

2.4 Western blot 檢測NAC 對關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2 蛋白的表達(dá)影響

與對照組SD 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織比較，TLR2 蛋白在模型組滑膜組織中表達(dá)增加明顯，而NAC 低、中、高劑量組滑膜組織中TLR2 蛋白含量較對照組升高，但較模型組明顯下降。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，NAC低、中、高劑量組較模型組滑膜組織TLR2 蛋白降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01）。見表3 及圖2。

圖2 各組滑膜組織TLR2 蛋白表達(dá)Fig 2 TLR2 protein expression in synovial tissues of rats in eac h group

表3 各組TLR2/β-actin 相對蛋白量表達(dá)（n=7，±s）Tab 3 Relative protein content（TLR2/β-actin）in each group（n=7，±s）

表3 各組TLR2/β-actin 相對蛋白量表達(dá)（n=7，±s）Tab 3 Relative protein content（TLR2/β-actin）in each group（n=7，±s）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

相對蛋白量0.21±0.03 0.67±0.04##0.56±0.07*0.38±0.05**0.32±0.03**組別對照組模型組NAC 低劑量組NAC 中劑量組NAC 高劑量組

2.5 ELISA 測定大鼠血清炎癥因子含量

與對照組比較，模型組血清中致炎因子TNF-α、IL-1β 相比較含量明顯增加，而IL-10 含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而NAC各 劑 量 組 致 炎 因 子TNF-α、IL-1β 含 量 下 降，而IL-10 含量明顯升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），見表4。

表4 各組血清炎癥因子比較（pg/mL，n=10，±s）Tab 4 Comparison of serum inflammatory factors in each group（pg/mL，n=10，±s）

表4 各組血清炎癥因子比較（pg/mL，n=10，±s）Tab 4 Comparison of serum inflammatory factors in each group（pg/mL，n=10，±s）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

IL-10 12.03±0.54 7.62±0.55##8.16±0.45*8.49±0.79*9.36±0.63**組別對照組模型組NAC 低劑量組NAC 中劑量組NAC 高劑量組TNF-a 470.57±27.94 830.32±65.04##759.94±63.07*742.50±71.11*605.87±56.03**IL-1β 12.15±1.50 34.98±3.13##30.59±3.73*24.35±2.81**20.13±2.34**

3 討論

RA 以破壞多發(fā)性小關(guān)節(jié)的軟骨組織和骨結(jié)構(gòu)的自身免疫病，當(dāng)患者機(jī)體在病痛、促炎因子、持續(xù)的關(guān)節(jié)滑膜炎癥等傷害性刺激下，組織細(xì)胞中氧自由基過度生成，使得機(jī)體氧化-抗氧化作用失調(diào)，機(jī)體過度的ROS 加重炎癥反應(yīng)，使得RA 病程進(jìn)展［9］。TNF-α、IL-1β 的過表 達(dá)會破壞關(guān)節(jié)滑膜和關(guān)節(jié)軟骨，引起骨侵蝕加重，骨修復(fù)系統(tǒng)長期遭受破壞，引起關(guān)節(jié)畸形，程度不等的關(guān)節(jié)強(qiáng)直和功能喪失。弗氏完全佐劑建立的AA 動物模型是研究RA 的常見動脈模型，本研究通過大鼠皮下注射弗氏完全佐劑，應(yīng)用關(guān)節(jié)腫脹度、關(guān)節(jié)炎指數(shù)，反映四肢炎性改變，結(jié)果證實(shí)造模成功。氧化應(yīng)激在AA 大鼠關(guān)節(jié)損傷中作用明顯，由致炎因子導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激是關(guān)節(jié)病變的重要原因［10］。本研究ELISA 檢測顯示，模型組血清中致炎因子TNF-α、IL-1β 較對照組明顯增加，而抑炎因子IL-10 含量明顯降低，說明AA大鼠炎癥的存在和損傷。

NAC 為還原性谷胱甘肽的前體，可促進(jìn)細(xì)胞谷胱甘肽（glutathione，GSH）的合成，增加血清中內(nèi)谷胱甘肽GSH 含量，清除ROS，從而實(shí)現(xiàn)多途徑抗生物氧化作用，NAC 是機(jī)體ROS 抑制劑，通過促進(jìn)還原型谷胱甘肽（GSH）生物合成，清除ROS 而抗氧化和抗炎功能［11］。本研究也證實(shí)，NAC 能劑量依賴性地改善AA 大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)和關(guān)節(jié)腫脹度，降低模型動物血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β 表達(dá)，升高抑炎細(xì)胞因子IL-10 表達(dá)，表明NAC 對AA大鼠抗氧化的同時(shí)，可有效降低炎癥損傷。

RA 的發(fā)病機(jī)制未明，持續(xù)性的滑膜炎是骨破壞重要因素，研究RA 發(fā)病過程中炎癥信號通路是認(rèn)識該病的重要方向［12］。TLR 和下游炎癥因子信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是免疫性炎癥的重要信號通路，TLR 過表達(dá)有可能在RA 發(fā)病中影響較大［13］。有研究發(fā)現(xiàn)在低氧和細(xì)菌脂多糖刺激下的大鼠睪丸炎模型中，在炎癥起始階段TLR2 活化后，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞黏附與侵襲睪丸生精細(xì)胞，導(dǎo)致精子生成障礙［14］。本研究通過免疫組化染色和蛋白免疫印跡均證實(shí)，相對于正常對照大鼠，AA 大鼠模型滑膜組織呈TLR2蛋白高表達(dá)，表明異常激活的TLR2 蛋白參與AA大鼠發(fā)病進(jìn)程中；而且，NAC 治療組滑膜組織中TLR2 蛋白表達(dá)水平較模型組明顯降低，且呈NAC濃度依賴趨勢，即隨著NAC 濃度升高，AA 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中TLR2 蛋白漸減弱，表明NAC 可能通過抑制TLR2 的活性而對AA 大鼠起到一定治療作用。TLR2 下游效應(yīng)細(xì)胞因子產(chǎn)生于單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞等，與炎癥疾病活動度有一定的相關(guān)性［15］。本研究表明，低劑量的NAC 即可明顯降低大鼠血清促炎因子IL-1β、TNF-α 降低，升高抑炎因子IL-10，但NAC 是否通過降低TLR2 活性，從而降低炎癥反應(yīng)有待進(jìn)一步機(jī)制研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

楊珺：實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析、文章撰寫；潘獻(xiàn)柱、汪曉慶：免疫組化實(shí)驗(yàn)；謝琳琳、劉梅梅：AA 造模及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的采集；趙大海、汪陶榮：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析；葉靜：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和文章審校；陳曉宇：實(shí)驗(yàn)統(tǒng)籌安排及文章審校。