鋅離子對血管細胞的毒性及其機理研究

摘要：金屬鋅是一種潛在的血管可降解支架材料，研究金屬鋅降解產(chǎn)生的離子對血管細胞的毒性及致機理，對可降解金屬鋅支架的研究與開發(fā)有重要參考價值。本文研究了不同濃度的Zn2+對血管內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞毒性及致毒機理。結(jié)果表明，對于不同細胞類型，Zn2+的毒性及作用機制均不相同。低濃度的Zn2+對內(nèi)皮細胞的毒性低于對平滑肌細胞的毒性。隨著濃度的升高內(nèi)皮細胞對Zn2+的毒性更加敏感，其主導的致死機制為不利于機體的細胞壞死。而平滑肌細胞的致死率直至Zn2+濃度到達300 μM才明顯提高，其主要致死機制為不會對機體造成負面損傷的細胞凋亡。除致死毒性外，Zn2+還會造成內(nèi)皮細胞的S期阻滯及平滑肌細胞的S期和G2-M期阻滯。

關(guān)鍵詞：鋅離子，血管內(nèi)皮細胞，血管平滑肌細胞，細胞凋亡，細胞壞死，細胞周期阻滯，毒性機理

Abstract： Zinc is a potential biodegradable vascular scaffold material.Study the toxicity of Zn2+ to vascular cells and the mechanism of toxicity is important to the research and development of zinc vascular scaffolds.In this paper， the toxicity of different concentrations of Zn2+ to vascular endothelial cells and smooth muscle cells were tested.The corresponding toxicity mechanism were studied.The results showed that the toxicity and mechanism were different for different cell types.The toxicity of low concentration of Zn2+ to endothelial cells was lower than that to smooth muscle cells.With the Zn2+ increasing， endothelial cells became more sensitive to the toxicity of Zn2+.The leading cell death mechanism was cell necrosis， which was unfavorable to vascular tissue.However， the death rate of smooth muscle cells was not obvious until the concentration of Zn2+ reached 300 μM.The smooth muscle cell death mechanism was apoptosis which did not cause negative damage to the tissue.In addition to toxicity leading to cell death， Zn2+ also caused S phase arrest of endothelial cells and S phase and G2 to M phase arrest of smooth muscle cells.

Key words： Zn2+; Vascular endothelial cells; Vascular smooth muscle cells; Cell apoptosis; Cell necrosis; Cell cycle arrest; Toxicity mechanism

冠脈血管狹窄導致的心肌梗死為人類健康的一大殺手，其主要治療手段為冠脈血管支架介入治療術(shù)。1血管支架在病變處擴張，使血流暢通，從而恢復心肌細胞的血供。臨床上使用的冠脈支架一般由不銹鋼、Pt等金屬材料制備，這些材料在體內(nèi)不可降解，長期遺留在體內(nèi)作為異物刺激血管，存在血管再狹窄的風險。因此，開發(fā)安全有效的可降解支架成為一種臨床需求。2高分子材料為可降解支架的主要備選材料，但高分子材料本身機械支撐力弱，不適于大血管病變，而金屬材料本身具有強度的優(yōu)勢，因此開發(fā)可降解金屬支架具有重要的意義。目前研究比較廣泛的可降解金屬材料為鐵、鎂、鋅等。3相比而言，金屬鋅降解產(chǎn)生的鋅離子為人體所需的微量元素，且金屬鋅具有較好的機械強度，因此，鋅是一種具有潛力的可降解金屬材料。研究表明，低濃度的鋅離子對組織細胞的增殖具有促進作用，但高濃度的鋅離子對組織細胞具有毒性。4在可降解材料植入血管內(nèi)的一段時間后，降解產(chǎn)生的離子可能在局部蓄積，勢必產(chǎn)生細胞毒性，對生命安全造成隱患。

細胞毒性按作用機制可分細胞致死和細胞周期阻滯。5細胞致死有兩種型式，包括細胞凋亡和細胞壞死。細胞凋亡一種細胞自主有序的死亡，是一個主動過程，不對機體造成負面損傷。細胞壞死是無序變化的死亡過程，往往會引發(fā)組織的急性炎癥反應。細胞周期阻滯是細胞停留在細胞周期的某一階段不能進入下一個時期的現(xiàn)象，理論上不影響細胞活力。

研究證實，鋅離子對不同種類的細胞的毒性機理不同。6但目前，仍缺乏鋅離子對血管細胞毒性機理的研究。而研究鋅離子的對血管細胞的毒性機制，對如何調(diào)控金屬鋅在體內(nèi)的降解模式具有重要參考價值。因此，本文的目的在于研究鋅離子對血管細胞的毒性機理，為開發(fā)可降解金屬鋅支架的可行性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與設備

1.1.1材料與試劑

ZnCl2（Sigma-Aldrich，Z0152），人主動脈血管平滑肌細胞（賽百慷，HA-VSMC），人臍靜脈內(nèi)皮細胞（賽百慷，icell-h110），血管平滑肌細胞培養(yǎng)基，原代內(nèi)皮細胞專用培養(yǎng)體系（賽百慷，PriMed-iCell-002），平滑肌細胞專用培養(yǎng)體系（賽百慷，PriMed-iCell-004）Annexin V-FITC （BD，556419）），7-AAD Staining Solution （BD，559925），PI/RNase Staining Buffer?（BD Pharmingen，550825） ，PBS（Invitrogen，14190-136），F(xiàn)BS （Corning， 35-076-CV）。

1.1.2儀器與設備

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo Scientific，Heracell VIOS 160i），水浴鍋（邁科諾，HJ-A2），超凈工作臺（力康，OptiClean 1300），渦旋振蕩儀（IKA，GENIUS 3），移液控制器（Sartorius，Midi Plus）電動移液器（Sartorius，eLINE），移液槍（Eppendorf，Research Plus），離心機 （Thermo Scientific，ST 40R），流式細胞儀（Beckman Coulter，CytoFLEX）。

1.2實驗方法

1.2.1鋅離子溶液配制

按照表1中的濃度，將ZnCl2分別溶解于人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）與人主動脈血管平滑肌細胞（HA-VSMC）基礎培養(yǎng)基中（不含血清）待用。

1.2.2細胞培養(yǎng)

在HUVEC和HA-VSMC用培養(yǎng)基內(nèi)分別培養(yǎng)兩種細胞至穩(wěn)定期。將穩(wěn)定期的細胞消化后，以106每孔的密度接種6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24小時，將孔板內(nèi)的培養(yǎng)基吸棄，用不含鋅離子、不含血清的培養(yǎng)基漂洗，之后向孔板內(nèi)加入預先配制的不同濃度的含Zn2+培養(yǎng)基，向培養(yǎng)基內(nèi)補充10%的FBS。24小時后收集細胞，并立即進行流式細胞儀檢測。

1.2.3細胞凋亡/壞死檢測

將待測樣品以1500 rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，吸棄上清液。向離心管中加 1ml的PBS緩沖液，輕柔吹打使細胞重懸均勻;再以1500 rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，吸棄上清液。向離心管中加 300μl Binding buffer，輕柔吹打使細胞重懸均勻;取100μl樣品，每管加入5μl Annexin V和5μl 7-AAD染色液重懸細胞;室溫避光放置15分鐘后，加入400μl Binding Buffer。用CytoFLEX流式細胞儀進行流式檢測。所有樣品需在1小時內(nèi)測完;利用FlowJo進行凋亡各時期的分析。

1.2.4 細胞周期阻滯測試

將待測樣品反復吹打均勻轉(zhuǎn)入15ml離心管。向每個離心管中加 5 ml的PBS，輕柔吹打使細胞重懸均勻，以1500 rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘棄上清;一邊將離心管置于半速渦旋，一邊滴加約5 ml 75%乙醇，在冰上孵育15分鐘后放入-20 ℃冰箱保存過夜;從冰箱取出固定后的樣品加入5 ml PBS，以1500 rpm 的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清，用1ml含有1% FBS的PBS洗再一次，最后加入500 μl PI/RNase Staining Buffer，室溫避光孵育20分鐘;用CytoFLEX流式細胞儀最低流速進行流式檢測。利用Modfit軟件進行周期的分析。

2實驗結(jié)果

2.1鋅離子濃度對細胞致死的影響

磷脂酰絲氨酸位于正常活細胞膜內(nèi)側(cè)，早期凋亡的細胞，其磷脂酰絲氨酸會從細胞膜內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)至細胞膜表面。膜聯(lián)蛋白-V（Annexin-V）是一種Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，是磷脂酰絲氨酸高親和力的結(jié)合物。7-氨基放線菌素（7AAD）是一種核酸染料，它無法透過完整的活細胞的細胞膜，但能夠透過死細胞的細胞膜而使細胞核染色。因此，將Annexin-V與7AAD匹配使用，就可對凋亡細胞以及壞死細胞進行區(qū)分。7Annexin V陽性（Annexin V+）并且 7AAD陽性（7AAD+）的細胞為晚期凋亡細胞，即壞死細胞。Annexin V陽性（Annexin V+）并且 7AAD陰性（7AAD-）為早期凋亡細胞，即凋亡細胞。Annexin V陰性（Annexin V-）并且 7AAD陰性（7AAD-）為活細胞。

2.1.1 鋅離子濃度與細胞活率

通過流式細胞儀檢測Annexin V-/7AAD-的細胞比例可以獲得細胞活率數(shù)據(jù)，結(jié)果如圖1中所示。1-1至1-5為濃度分別為10 μM、50 μM、100 μM、300 μM、500 μM的Zn2+對應的HUVEC的細胞活率。2-1至2-5為濃度分別為10 μM、50 μM、100 μM、300 μM、500 μM的Zn2+對應的HA-VSMC的細胞活率。HUVEC在低Zn2+濃度下相比HA-VSMSC具有較高的活率，隨著Zn2+濃度的增加，HUVEC活率快速降低，當Zn2+濃度達到500 μM時，細胞活率接近為零。HA-VSMC在10 μM Zn2+濃度時活率低于HUVEC，但隨著Zn2+濃度的增加，HU-VSMC活率降低不明顯，直至Zn2+濃度達到300 μM時，細胞活率有明顯降低?？梢娧軆?nèi)皮細胞相比平滑肌細胞對Zn2+濃度變化更敏感。

2.1.2細胞致死結(jié)果

通過流式細胞儀檢測Annexin V+/7AAD-、Annexin V+/7AAD+的細胞比例可以獲得細胞凋亡和細胞壞死比率，結(jié)果如圖2中所示。1-1至1-5為濃度分別為10 μM，50 μM，100 μM，300 μM，500 μM的Zn2+對應的HUVEC的細胞凋亡與壞死比率。隨著Zn2+的增加，HUVEC的壞死率逐漸增加，細胞凋亡率首先呈現(xiàn)上升趨勢，高于壞死比率，隨后維持在一個穩(wěn)定的百分比，低于壞死比率，最后呈現(xiàn)下降趨勢。說明，對于內(nèi)皮細胞，在低濃度條件下，Zn2+細胞致死的毒性機制主要為細胞凋亡，超過300 μM后細胞致死的毒性機制主要為細胞壞死。2-1至2-5為濃度分別為10 μM、50 μM、100 μM、300 μM、500 μM的Zn2+對應的HA-VSMC的細胞凋亡與壞死比率。當Zn2+濃度在10 μM至300 μM范圍內(nèi)時，細胞壞死率處于相對穩(wěn)定的水平，壞死率略高于凋亡率。當Zn2+濃度上升至500 μM時細胞壞死比率明顯升高。當Zn2+濃度在10 μM至100 μM范圍內(nèi)時，細胞凋亡率處于相對穩(wěn)定的水平。當Zn2+濃度上升至300 μM時細胞凋亡率明顯升高，凋亡率明顯高于壞死率。說明，對于平滑肌細胞，在低濃度條件下，Zn2+細胞致死的毒性機理兼有細胞壞死與細胞凋亡，在高濃度調(diào)節(jié)下，細胞凋亡為主導的細胞致死機理。

2.2細胞周期阻滯結(jié)果

細胞周期是分為間期與分裂期兩個階段。8間期包含G1期、S期與G2期。G1期為DNA合成前期，主要DNA復制作準備，此期細胞具有常規(guī)二倍體的細胞的DNA含量。S期為DNA合成期，主要合成DNA，此期DNA含量介于二倍體和四倍體之間。G2期為DNA合成后期，細胞在此期終止DNA合成，此期細胞具有四倍體細胞的DNA含量。細胞分裂期即M期，細胞完成分裂，染色體均等地傳遞至下一代細胞。M期之后，有的細胞可繼續(xù)分裂進入下一周期，有的細胞轉(zhuǎn)入G0期，脫離細胞周期暫時停止分裂。

碘化丙啶（PI），可以與細胞內(nèi)DNA和RNA結(jié)合，通過流式細胞儀檢測PI的熒光強度可直接反饋細胞內(nèi)DNA含量，因此可分辨處于細胞周期各時相的細胞的百分比的哪一階段。9在檢測中如果發(fā)現(xiàn)處于某個時相的細胞百分率有顯著性升高，則說明細胞周期在這一時相受到了阻滯。圖3為流式細胞儀檢測的細胞周期阻滯結(jié)果。1-1至1-5為濃度分別為10 μM、50 μM、100 μM、300 μM、500 μM的Zn2+對應的HUVEC的細胞處于不同周期時相的比率，隨著Zn2+的增加，處于G2-M期的細胞比率略有上升，但不顯著。處于S期的細胞比率呈明顯上升趨勢。處于G0-G1期的細胞呈明顯下降趨勢。說明，Zn2+對內(nèi)皮細胞周期的阻滯作用發(fā)生在S期，即DNA合成期。2-1至2-5為濃度分別為10 μM、50 μM、100 μM、300 μM、500 μM的Zn2+對應的HA-VSMC的細胞處于不同周期時相的比率，在濃度Zn2+處于10 μM至300 μM范圍內(nèi)時，處于G0-G1期、S期以及G2-M期的細胞比率無顯著改變，Zn2+升至500 μM后S期及G2-M期的細胞比率明顯增加，G0-G1期的細胞比率明顯降低。說明，Zn2+主要阻滯平滑肌細胞的S期和G2-M期，即合成期至分裂期。

3討論

促進內(nèi)皮損傷修復并抑制平滑肌細胞增生是冠脈血管支架介入治療后病變恢復的關(guān)鍵。10因此，支架的設計一般都會考慮減少對血管內(nèi)皮細胞的刺激，加強對平滑肌細胞增生的抑制。細胞凋亡和細胞周期阻滯理論上不會對機體造成負面損傷，而細胞壞死會帶來一系列的機體損傷效應。金屬鋅支架在體內(nèi)降解模式需滿足：一方面，產(chǎn)生的鋅離子不可導致內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞的大量壞死;另一方面，應減少對內(nèi)皮細胞的損傷，加強對平滑肌細胞的抑制。在低濃度條件下Zn2+對于內(nèi)皮細胞致死的毒性機制主要為細胞凋亡，超過一定濃度后細胞致死的毒性機制主要為細胞壞死。Zn2+對內(nèi)皮細胞周期的阻滯作用于S期。在低濃度條件下，Zn2+對平滑肌細胞致死的毒性機制兼有細胞壞死與細胞凋亡，在高濃度條件下，細胞凋亡為主導的細胞致死機制。Zn2+對平滑肌細胞周期阻滯在低濃度條件下不明顯，在升至500 μM后細胞周期阻滯作用于S期和G2-M期。在支架植入初期，由于支架植入過程的擴張作用，內(nèi)皮會有一定程度的損傷，為確保內(nèi)皮修復，初期支架降解釋放的Zn2+可維持在50 μM以下，在該濃度范圍內(nèi)，Zn2+對內(nèi)皮細胞的損傷作用較弱，對平滑肌細胞的損傷作用較強，可起到促進內(nèi)皮修復抑制平滑肌增生的作用。一般支架植入體內(nèi)2周至4周后，支架桿會被平滑肌細胞包裹，內(nèi)皮細胞生長于平滑肌細胞層之上，完成內(nèi)皮層修復。之后，為抑制平滑肌細胞的增生導致的血管再狹窄，支架桿向血管腔方向釋放的Zn2+依然需維持在較低水平，以減少對內(nèi)皮層的刺激，而支架桿向血管壁方向釋放的Zn2+可提升至較高的濃度水平（高于300 μM），誘導平滑肌細胞的凋亡，而不造成對機體的負面損傷。在實際研究中，可通過金屬冶煉工藝的開發(fā)以及涂層應用是實現(xiàn)對降解的調(diào)控。

4 結(jié)論

本文研究了10 μM至500 μM濃度范圍內(nèi)的Zn2+對血管內(nèi)皮細胞與平滑肌細胞毒性機制。對于不同細胞類型，Zn2+的致死作用機制不同。低濃度的Zn2+對內(nèi)皮細胞的毒性作用低于對平滑肌細胞的毒性作用。隨著濃度的升高內(nèi)皮細胞對Zn2+的毒性更加敏感，其主導的致死方式為不利于機體的細胞壞死。而平滑肌細胞的致死率直至Zn2+濃度到達300 μM才逐漸顯現(xiàn)，其主要致死方式為不會對機體造成負面損傷的細胞凋亡。除致死毒性外，Zn2+還會造成內(nèi)皮細胞的S期阻滯及平滑肌細胞的S期和G2-M期阻滯。本研究可以為可降解鋅支架的研發(fā)提供理論參考。

參考文獻

[1]Chan PS， Patel MR， Klein LW， Krone RJ， Dehmer GJ， Kennedy K， Nallamothu BK， Weaver WD， Masoudi FA， Rumsfeld JS， Brindis RG and Spertus JA.Appropriateness of Percutaneous Coronary Intervention [J].JAMA.2011;306：53-61.

[2]Chen MS， John JM， Chew DP， Lee DS， Ellis SG and Bhatt DL.Bare metal stent restenosis is not a benign clinical entity [J].American Heart Journal.2006;151：1260-1264.

[3]Hermawan H， Dubé D and Mantovani D.Developments in metallic biodegradable stents [J].Acta Biomaterialia.2010;6：1693-1697.

[4]劉霞，任廣達，單偉，曾瑞霞，李德華，秦書儉.鋅對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞DNA和蛋白質(zhì)含量及增殖周期的影響[J].中國組織工程研究與臨床康復.13：1901-1904.

[5]Vermeulen K， Berneman ZN and Van Bockstaele DR.Cell cycle and apoptosis.2003;36：165-175.

[6]Wang Y-h， Li K-j， Mao L， Hu X， Zhao W-j， Hu A， Lian H-z and Zheng W-j.Effects of Exogenous Zinc on Cell Cycle， Apoptosis and Viability of MDAMB231， HepG2 and 293?T Cells [J].Biological Trace Element Research.2013;154：418-426.

[7]Zimmermann M.MN.Annexin V/7-AAD Staining in Keratinocytes.In： Stoddart M.（eds） Mammalian Cell Viability.Methods in Molecular Biology （Methods and Protocols） [M].Humana Press.2011;170.

[8]Vermeulen K， Berneman ZN and Van Bockstaele DR.Cell cycle and apoptosis [J].Cell Proliferation.2003;36：165-175.

[9]Kim KH and Sederstrom JM.Assaying Cell Cycle Status Using Flow Cytometry [J].Curr Protoc Mol Biol.2015;111：28.6.1-28.6.11.

[10]Virmani R and Farb A.Pathology of in-stent restenosis [J].Curr Opin Lipidol.1999;10：499-506.

作者簡介：王玄，性別：女，出生年月：1988年9月，籍貫：安徽省蚌埠市，學歷：博士研究生，職稱：無，研究方向：生物醫(yī)用材料。

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