呼吸道病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)

魯健康

呼吸道感染是臨床上最多見的一種癥狀，也是引起疾病和死亡的重要因素?？梢l(fā)呼吸道感染的病原菌有很多種，比如細(xì)菌、病毒、衣原體和支原體等，特別是病毒感染更多見。無(wú)論是哪種病原菌引起的感染，呼吸道感染的臨床表現(xiàn)都比較相似，但治療方法卻截然不同，所以，需要快速準(zhǔn)確檢測(cè)出到底是感染了哪種病原菌，然后對(duì)癥治療，才能獲得有效的治療效果。在分子生物技術(shù)快速發(fā)展的今天，呼吸道病毒的檢測(cè)方法也不僅僅只依靠分離培養(yǎng)和免疫學(xué)技術(shù)，基因芯片和下一代測(cè)序技術(shù)等都獲得了廣泛應(yīng)用，而且檢測(cè)效果更快、更靈敏，同時(shí)還具有特異性和高通量等，可滿足疾病治療的需求，下面我們一起了解下呼吸道病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)。

1 、病毒分離培養(yǎng)

病毒分離培養(yǎng)法是呼吸道病毒檢測(cè)方法中最經(jīng)典的一種，也是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。傳統(tǒng)的方法是將鼻咽的分泌物接種在敏感細(xì)胞，使用含2%小牛血清作為培養(yǎng)基，然后觀察細(xì)胞狀態(tài)，全過(guò)程需要大概7-15天左右，時(shí)間比較長(zhǎng)，不利于疾病的早期診斷與治療，而且有些病毒的陽(yáng)性檢出率比較低。20世紀(jì)90年代時(shí)，使用了載玻片培養(yǎng)，先采用低溫離心然后再進(jìn)行培養(yǎng)，隔天再使用單克隆抗體染色，可清楚查看到感染的細(xì)胞。該方法對(duì)病毒分離培養(yǎng)的時(shí)間需要1-2天，縮短的檢測(cè)時(shí)間，為病人的治療爭(zhēng)取了更多有效時(shí)間。

2 、免疫學(xué)技術(shù)

直接免疫熒光技術(shù)指的是使用標(biāo)有熒光素的抗病毒抗體和組織中的病毒抗原直接發(fā)生反應(yīng)。該方法操作起來(lái)非常簡(jiǎn)單，時(shí)間也比較短，還具有較高的特異性和敏感性，更有利于實(shí)驗(yàn)室工作的進(jìn)行，是常用的呼吸道病毒檢測(cè)方法。但該方法需要使用鼻咽深部的分泌物，會(huì)使病人更加痛苦。

間接免疫熒光技術(shù)指的是首先選擇相應(yīng)病毒抗原與特異性抗體相結(jié)合，形成一種新的抗原抗體復(fù)合物，然后將該復(fù)合物與熒光標(biāo)記的二抗進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)熒光顯微鏡去觀察。該方法可以同時(shí)對(duì)多種病毒進(jìn)行檢查，但敏感性比較低，也會(huì)受到很多因素的影響。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)指的是利用抗原抗體的特異性與具有高效催化作用的酶相結(jié)合，檢測(cè)出呼吸道病毒抗原，還能檢測(cè)出相應(yīng)病毒的抗體，該方法具有較高的敏感性，較強(qiáng)的特異性，而且也不存在放射性污染，所以是應(yīng)用范圍較廣的實(shí)驗(yàn)室呼吸道病毒檢測(cè)方法。

3 、芯片技術(shù)

芯片技術(shù)是對(duì)基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行研究的一項(xiàng)有力工具。芯片技術(shù)與宏基因組學(xué)方法可快速鑒別診斷出病毒。該方法能夠幫助發(fā)現(xiàn)新的病毒，就算病毒沒有基因恒定區(qū)，也可通過(guò)測(cè)序獲得檢測(cè)結(jié)果，測(cè)序與微陣列芯片相結(jié)合也是一種非常強(qiáng)大的高通量診斷方法。

液相芯片技術(shù)是由很多大小一樣的圓形微球構(gòu)成，每個(gè)微球上都裝有相應(yīng)的熒光標(biāo)記的分子探針，然后通過(guò)熒光信號(hào)去測(cè)定呼吸道病毒，該方法屬于一種新型生物技術(shù)平臺(tái)。

4 、下一代測(cè)序技術(shù)

從21世紀(jì)初，下一代測(cè)序就徹底改變了基因組學(xué)的領(lǐng)域，使得以前很多無(wú)法進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)都得到廣泛開展。下一代測(cè)序具有多樣本、多功能和高通量的特點(diǎn)提高了呼吸道病毒檢測(cè)效果。

下一代測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了很多新病毒，很多病毒和菌株都是通過(guò)該方法鑒別檢查出的，比如2013年發(fā)現(xiàn)的副流感病毒。下一代測(cè)序具有的高敏感性實(shí)在令人難以置信，該方法能同時(shí)檢查多個(gè)病人的樣本，準(zhǔn)確檢測(cè)出特定病原和病毒抗體，然后進(jìn)行適當(dāng)?shù)闹委?。與Sanger測(cè)序比較來(lái)說(shuō)，下一代測(cè)序從單個(gè)堿基來(lái)講存在一定的價(jià)格優(yōu)勢(shì)，但如果只從單個(gè)反應(yīng)而講，價(jià)格還是比較貴的，而且多數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)于該技術(shù)的認(rèn)知不足，需求也不大。而且該技術(shù)從樣本準(zhǔn)備到完善數(shù)據(jù)需要兩三天的時(shí)間，每個(gè)反應(yīng)都會(huì)產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)，需要具備豐富經(jīng)驗(yàn)的具有專業(yè)生物信息技術(shù)的人員分析。雖然面臨很多問(wèn)題，但相信都會(huì)不斷完善，最后下一代測(cè)序會(huì)在呼吸道病毒實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中獲得重要地位，發(fā)揮重要作用。

5 、納米技術(shù)

納米技術(shù)的出現(xiàn)也為科學(xué)發(fā)展開啟了新的方向。當(dāng)物質(zhì)發(fā)生變化縮小到納米級(jí)別時(shí)，就需要使用納米技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)揮它特有的功能。免疫聚合酶鏈反應(yīng)是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)與聚合酶鏈反應(yīng)的結(jié)合，常用于多種病毒和細(xì)菌的檢測(cè)。有研究人員使用金標(biāo)的納米顆粒改進(jìn)免疫聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)出呼吸道合胞病毒，檢出率能達(dá)4.1pfu/ml，該方法的檢測(cè)敏感性要比聚合酶鏈反應(yīng)的敏感性高出4000倍之多。

若想建立起該種檢查體系對(duì)呼吸道病毒進(jìn)行檢測(cè)，還是比較難的，特別是病毒感染的初期階段。但由于分子標(biāo)記技術(shù)的出現(xiàn)，活細(xì)胞追蹤成為可能，所以成功檢測(cè)出呼吸道合胞病毒。

總之，呼吸道病毒是造成呼吸道感染的重要因素，在眾多抗病毒藥物的廣泛使用，很多病毒對(duì)于常用藥物都會(huì)產(chǎn)生耐藥性，而且還有新的病毒在不斷威脅大家的健康，所以需要一種快速、靈敏且具有特異性的檢測(cè)方法來(lái)控制疾病的爆發(fā)，也避免亂用藥物。傳統(tǒng)的常用的病毒檢測(cè)方法是病毒分離培養(yǎng)法，雖然具有檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但用時(shí)比較長(zhǎng)，很難應(yīng)用于臨床治療。免疫熒光法，可在幾個(gè)小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，是目前臨床常用的病毒檢測(cè)方法。此外，還有芯片技術(shù)、下一代測(cè)序技術(shù)、納米技術(shù)以及質(zhì)譜分析技術(shù)等。目前，分子檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏度、用時(shí)短和高特異性等特點(diǎn)日益成熟。

（西昌市疾病預(yù)防控制中心 四川 西昌 615000）