干擾素誘導的四肽重復序列(IFIT)基因家族蛋白抗病毒作用機制研究進展

許 凡，黨 文，田 宏，鄭海學

(中國農(nóng)業(yè)科學院 蘭州獸醫(yī)研究，甘肅 蘭州 730046)

干擾素誘導的四肽重復序列(interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats，IFIT)基因的發(fā)現(xiàn)，最早可以追溯到20世紀80年代，其中，人類干擾素刺激基因56(human IFN-stimulated gene 56，ISG56，正式基因符號IFIT1)就是一種IFIT基因，也被稱為561基因[1-2]，之后IFT2、IFIT3、IFIT5也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，開啟了IFIT基因家族研究，在近幾年取得重大進展。IFIT蛋白對多種病毒表現(xiàn)出良好的抑制效果， IFIT蛋白本底表達水平較低，在Ⅰ型干擾素(type Ⅰ interferon,IFN-Ⅰ)的刺激下或病毒感染后高度表達[3]。當病原體入侵機體后激活宿主先天性免疫反應，誘導IFNs大量表達。這些IFNs進一步激活JAK-STAT通路，刺激細胞表達大量干擾素刺激基因(ISGs)，啟動宿主抗病毒免疫反應[4-5]。

不同類型的病原體均能誘導機體產(chǎn)生大量IFIT蛋白。病原體入侵宿主細胞，宿主細胞的病原識別受體(pathogen recognition receptors,PRRs)感受和偵測病原體相關的分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMPs)，最終啟動免疫應答[6]。 PRRs包括Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)與RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ like receptors,RLRs)，兩者都可激活IFIT基因的表達[7]。TLRs家族根據(jù)分布特征主要分為普遍存在型(TLR1)、限制存在型(TLR2、TLR4、TLR5)以及特異存在型(TLR3)3類。TLRs激活后可使干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)和干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)磷酸化，隨后磷酸化的IRF3和IRF7進入細胞核，誘導IFN-Ⅰ，IFN-Ⅰ進一步刺激IFIT蛋白的表達[8]。RLR家族主要包括黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation-associated gene-5,MDA-5)，視磺酸誘導表達基因Ⅰ(retinoic acid-inducible gene Ⅰ,RIG-Ⅰ)以及遺傳學和生理學實驗室蛋白2(laboratory of genetics and physiology 2，LGP2)3類成員[9]，分別由ifih1、Ddx58和Dhx58基因表達而來。雙鏈RNA(dsRNA)或單鏈RNA(ssRNA)病毒入侵細胞后，其RNA暴露并被RLR識別，最終激活RLR信號通路。當RIG-Ⅰ和MDA-5被激活，可以進一步活化接頭分子線粒體抗病毒信號蛋白(mitochondrail antiviral signaling,MAVS)[10]。RLR與MAVS之間的CARD-CARD相互作用可以激活干擾素激酶，進一步磷酸化激活相應的IRF3或IRF7，以及細胞核因子κB(NF-κB)，誘導干擾素-α/β(IFN-α/β)表達[11]。IFN-α/β可通過自分泌或者旁分泌方式，誘導大量抗病毒基因表達，其中就包括 IFIT基因家族[7,11-12](圖1)。

注：RLR和IFIT家族蛋白分別識別5′端修飾后雙鏈RNA(dsRNA)、單鏈RNA(ssRNA)信號通路以及5′端修飾的化學結(jié)構(gòu)[13-14]

2 IFIT基因家族的基因結(jié)構(gòu)和蛋白特征

IFIT家族基因只存在于鳥類、哺乳動物類、魚類、兩棲動物中，在酵母、線蟲、植物等低等生物中未有報道。IFIT家族基因主要有4個成員，分別為IFIT1/ISG56、IFIT2/ISG54、IFIT3/ISG60和IFIT5/ISG58[15]，其中IFIT5只在禽類中有報道[16]。IFIT家族成員都是由 2個外顯子和1個內(nèi)含子組成：第1個外顯子只編碼5′-UTR(untranslated region) 區(qū)和起始密碼子區(qū)，第2個外顯子編碼CDS(coding sequences)區(qū)和3′-UTR 區(qū)。在TATA Box啟動子的上游200 bp左右有干擾素刺激應答元件(IFN stimulated response elements,ISRE)，這是唯一可識別的順式作用元件[15]。IRF具有識別這些元件的能力，各種刺激因素也可激活這些元件，并誘導相應的mRNA進行轉(zhuǎn)錄過程。不同的IFIT 家族成員所具有的ISRE的數(shù)目存在差異[17]，其中IFIT1、IFIT2和IFIT3有2個ISRE，而IFIT5有3個ISRE[18](圖2)。

注：標記了外顯子與內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)以及開放閱讀框(箭頭方向所示)；ISRE在啟動子中的位置(星號表示)和數(shù)量(星號個數(shù))，其中豬的基因中ISRE數(shù)量未知[15]

IFIT蛋白家族相對分子質(zhì)量為54～56 kDa，其特征是具有多拷貝串聯(lián)陣列的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序形成螺旋管式支架結(jié)構(gòu)，即由34個退化的氨基酸組成的螺旋-折疊-螺旋構(gòu)象的三角形四肽重復(tetratricopeptide repeats,TPRs)結(jié)構(gòu)域[18]，這種結(jié)構(gòu)域可介導多種蛋白-蛋白之間的相互作用，涉及翻譯起始、病毒復制、細胞遷移和增殖等[19]。IFIT家族成員間的TPR數(shù)量各不相同。IFIT2有9個TPR結(jié)構(gòu)，以二聚體形式存在，其C端部分折疊成超螺旋結(jié)構(gòu)，并在內(nèi)表面有帶正電荷的核苷酸結(jié)合通道，可以特異性的結(jié)合富含AU的RNA或RNA元件[20]。IFIT5擁有8或9個TPR結(jié)構(gòu)，形成鉗夾結(jié)構(gòu)，內(nèi)側(cè)正電荷，外側(cè)負電荷，空隙處可識別特定的RNA結(jié)構(gòu)[21]。這種結(jié)構(gòu)使得IFIT基因可以在抗病毒應答中發(fā)揮重要作用。

IFIT蛋白家族具有以下特點：α/β-干擾素可以誘導一定數(shù)量具有相互作用的蛋白發(fā)生實質(zhì)性變化，即IFIT1、IFIT2和IFIT3這3個蛋白只有在他們相互結(jié)合時，才會在α/β-干擾素的誘導下大量表達；IFIT蛋白可以通過招募其他細胞蛋白，并與它們組裝成干擾素，進而觸發(fā)一系列的細胞免疫機制來發(fā)揮功能。其中IFIT1B(IFIT蛋白家族中的亞類)可以與IFIT3進行連接，并相互交流，傳遞信息[22]。

3 IFIT基因家族蛋白的抗病毒作用機制

3.1 IFIT通過結(jié)合發(fā)生特定變化的病毒RNA來抑制其復制和轉(zhuǎn)錄多數(shù)原核細胞通過rRNA和tRNA 5′端的單磷酸與mRNA的N7-甲基鳥苷帽(cap0)結(jié)合形成5′-三磷酸鹽橋連接到第1個堿基，并招募RNA翻譯起始的細胞因子啟動翻譯[23]。大多數(shù)真核細胞進行蛋白翻譯時則依賴于mRNA的5′端的帽結(jié)構(gòu)且N-7和2′-O的甲基化結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生cap1(m7GpppNmN)或cap2(m7GpppNmNm)結(jié)構(gòu)[24]，cap1和cap2成為了真核細胞進行翻譯的關鍵。研究表明，RNA 5′端的構(gòu)成，包括其cap結(jié)構(gòu)及甲基化狀態(tài)，是宿主識別自身和非自身的決定性因素。有趣的是，在人和小鼠模型的研究中證明，小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)感染后，在IFIT1、IFIT2和IFIT3中只有IFIT1介導了IFIT復合物與cap-RNA的結(jié)合，并且有直接的相互作用，而IFIT5僅僅只與ppp-RNA結(jié)合，不與cap-RNA結(jié)合，因此IFIT1的特異性結(jié)合對于人和小鼠的IFIT復合物與其RNA靶標的募集是必不可少的[25]。是否可以找到一種方法，使病毒2′O位置不發(fā)生甲基化反應，或消除其甲基化，從而更加利于IFIT1或IFIT5蛋白的結(jié)合，發(fā)揮抗病毒效應。

3.2 IFIT通過結(jié)合病毒RNA 5′端的三磷酸堿基抑制病毒RNA復制當單鏈RNA病毒在進入宿主后，會在5′端生成1個三磷酸基團，即ppp-RNA結(jié)構(gòu)，便于病毒復制，也可區(qū)別于宿主RNA。IFIT1和IFIT5蛋白具有1個內(nèi)為正電荷，外為負電荷的閉合鉗夾結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)通過識別5′-RNA片段來鑒別細胞和病毒的mRNA，并以非序列特異性方式直接結(jié)合病毒的ppp-RNA并相互作用，啟動宿主的抗病毒反應，抑制水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)和流感病毒(influenza virus)病毒RNA復制(圖4)[26]。同時，IFIT2和IFIT3在抗病毒免疫中可以形成復合物穩(wěn)定此結(jié)構(gòu)，其中IFIT3通過YxxxL基序可以與IFIT1結(jié)合為二聚體，促進IFIT1與寨卡病毒(Zika virus)的mRNA中cap0結(jié)構(gòu)的結(jié)合，使IFIT1穩(wěn)定表達，發(fā)揮兩者結(jié)合作用保證反應的進行[22,27-29]。而宿主細胞的RNA通常有cap1或cap2甲基化結(jié)構(gòu)，避免了與IFIT結(jié)合，防止發(fā)生自身免疫，影響正常生理活動。

在最新研究中， IFIT1和IFIT5與mRNA配體相互作用的動力學分析顯示，cap結(jié)構(gòu)的改變對IFIT1/RNA復合物的穩(wěn)定性有較大的影響，其中，IFIT1與GpppG/A- 和 m7GpppG/A-RNAs形成的復合物最為穩(wěn)定，而對于IFIT5來說，含有NAD+和NADH作為帽結(jié)構(gòu)的RNA與IFIT5結(jié)合后，其動力學參數(shù)與IFIT5結(jié)合pppG-RNA后的參數(shù)相當[30]。此研究向大家展示了含有NAD+和NADH帽子結(jié)構(gòu)的RNA具有與pppG為帽子結(jié)構(gòu)的RNA相同的作用，可以結(jié)合IFIT5，參與免疫反應，保護機體。那么，是否可以通過人為的方式在RNA末端添加或使其較容易形成NAD+和NADH的帽子結(jié)構(gòu)，抑制病毒復制，為對抗病毒感染提供新的研究思路。

3.3 IFIT可競爭性結(jié)合elF3間接抑制病毒翻譯過程IFIT基因家族還可以通過另外一種途徑抵抗病毒侵襲。真核細胞翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor 4E/4F,eIF)elF3，是一種可以調(diào)控某些蛋白翻譯的多亞基蛋白復合物，通過與elF2-GTP-MET-tRNA三聚體和40S亞基結(jié)合形成43S起始復合物，再結(jié)合到病毒5′端mRNA 的cap結(jié)構(gòu)形成43S-mRNA復合物，從而開始翻譯相應蛋白[31]。在抗病毒免疫中，IFIT不但可以通過與elF2-GTP-MET-tRNA三聚體競爭性結(jié)合eIF3來抑制43S復合物的形成，還能夠緊密結(jié)合到病毒未甲基化的cap0-mRNA上面，從而抑制丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)5′端mRNA cap結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的翻譯(圖3)[25-26,32]，而eIF3在隨后的蛋白質(zhì)合成過程中抑制了細胞核病毒中60%以上的翻譯過程，起到抑制病毒增殖的功效[33-34]。

3.4 IFIT可直接結(jié)合病毒表面蛋白阻礙病毒復制IFIT1還可以通過直接結(jié)合病毒的蛋白，防止其進入細胞核來抑制病毒復制。病毒的E1解旋酶蛋白具有ATP酶和DNA解旋酶活性，是病毒復制所必須的蛋白。在IFIIT1抑制人類乳頭狀瘤細胞病毒(human papilloma virus，HPV)研究中發(fā)現(xiàn)，IFIT1可直接結(jié)合HPV的E1解旋酶，使其滯留在細胞質(zhì)內(nèi)，防止進入細胞核內(nèi)形成復合體結(jié)構(gòu)，有效地抑制了病毒的復制[35]。

3.5 IFIT通過調(diào)節(jié)多種細胞因子發(fā)生關聯(lián)作用間接抑制病毒復制IFIT1通過破壞MITA蛋白(可以激活IRF3的介質(zhì))、MAVS(可發(fā)揮線粒體抗病毒作用的信號蛋白)以及TANK結(jié)合激酶1(tANK binding kinse 1,TBK1)之間的相互作用來負反饋調(diào)節(jié)細胞的抗病毒反應，而這些相互作用的傳遞源自于RLRs識別的病毒信號。IFIT1的過表達也可抑制仙臺病毒(Sendai virus,SeV)誘導的IFN-β、NF-κB和IRF-3的激活作用[36](圖3)。IFIT1和IFIT2可直接與eIF3結(jié)合，抑制病毒基因的轉(zhuǎn)錄;IFIT1、IFIT2和IFIT3在細胞質(zhì)中形成復合物，識別和殺死病毒的ppp-RNA;同樣的，IFIT5也可直接對ppp-RNA產(chǎn)生殺傷作用。IFT1干擾MITA、MAVS和TBK1之間的相互作用，從而負反饋調(diào)節(jié)細胞的抗病毒反應。IFIT2與MITA相互作用，通過先天性免疫反應誘導的線粒體途徑誘導細胞發(fā)生凋亡。IFIT3在線粒體中連接TBK1和MAVS，協(xié)同加強IRF3和NF-κB的激活，進一步激活細胞的免疫應答。

IFIT5作為禽類中唯一存在的IFIT家族成員，發(fā)揮著保護禽類抵抗病毒，免受侵害的重要功能。VANDERVEN等[37]研究發(fā)現(xiàn)在鴨肺部感染高致病性甲型流感病毒(IAV)后，通過qRT-PCR測定，IFIT5的表達量明顯上升。近年，WU等[38]在鴨胚成纖維細胞(DEFs)感染鴨坦布蘇病毒(duck Tembusu virus，DTMUV)研究中也發(fā)現(xiàn)，鴨IFIT5(duIFIT5)的過表達可以顯著抑制IFN-β的轉(zhuǎn)錄和IFN-β啟動子的激活，并且能夠明顯抑制NF-κB和IRF7啟動子，以及下游IFN誘導的干擾素刺激反應元件(ISRE)啟動子的激活，以此來調(diào)節(jié)DTMUV的復制并抑制病毒激發(fā)的先天性免疫應答，起到保護宿主的作用。

圖3 IFIT家族基因的抗病毒和免疫調(diào)節(jié)功能

4 總結(jié)與展望

近些年來，隨著人類活動的日益頻繁，不同地理位置的人與人之間的聯(lián)系日益密切，一些傳染病和新發(fā)病的傳播更加頻繁，給人和畜禽的生命安全帶來了巨大威脅。在此之下，通過先天性免疫途徑保護生命健康問題已成為了研究的熱門，其中IFIT基因家族作為干擾素刺激因子中的關鍵因子，在抗病毒免疫的研究中發(fā)揮著重要的指示作用，能夠幫助我們更深入的了解宿主的抗病毒機制。

人類至今已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IFIT基因家族針對不同病毒保護機體的多種抗病毒策略。IAV可通過水禽、野鴨等在野生鳥類中自然傳播，并可擴散到其他物種，包括人類，導致人類暴發(fā)較高的并發(fā)率和死亡率[39]。HOU等[40]研究證實，人感染IAV后，可在體內(nèi)檢測到IFIT1、IFIT2、IFIT3的表達量顯著上調(diào)，而流感病毒的復制和轉(zhuǎn)錄明顯下降。巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)是皰疹病毒組DNA病毒，可引起以生殖泌尿系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肝臟疾患為主的各系統(tǒng)感染[41]。ZHU等[43]研究表明，人感染CMV后的8 h，IFIT2可大量表達[42]。腺病毒(adenovirus)是一種雙鏈DNA病毒，可誘發(fā)呼吸道的感染。ZHAO等[44]發(fā)現(xiàn)，在腺病毒感染后，機體IFIT1和IFIT2被激活表達，參與抗病毒反應。漢坦病毒(Hantan virus， HTNV)是一種負鏈RNA病毒，可引起肺部和腎臟嚴重病癥，危害人民生命[45]。當內(nèi)皮細胞受HTNV感染時，IFIT3被大量誘導表達，激發(fā)體內(nèi)抗病毒反應[46]。猿猴病毒40是一種微小、具有DNA的乳頭狀瘤空泡型病毒，能誘導細胞轉(zhuǎn)化，已被廣泛的用于基礎研究及基因工程載體的組建[47]。在RATHI等[48]研究中發(fā)現(xiàn)，猿猴病毒40可誘導細胞IFIT基因顯著上調(diào)

IFIT基因家族擁有良好的抗病毒作用的發(fā)現(xiàn)，使人們在先天性免疫研究領域取得重要進展?？偨Y(jié)前人的經(jīng)驗與成果,是否可以通過調(diào)控某些免疫通路中的某個因子，或通過人為因素修飾病毒，使機體對于病毒更加敏感，識別更加精準，捕獲更加靈敏，從而發(fā)揮進一步的清除功能，保護機體。

到目前為止，盡管在IFIT基因家族的抗病毒機制上的研究已取得階段性進展，在DNA、RNA病毒上，IFIT基因都能發(fā)揮抗病毒作用，但如何使IFIT基因家族發(fā)揮出最大、最好的抗病毒效應，IFIT基因家族又是如何從體內(nèi)清除病毒的，是科研人員需要進一步研究的問題，從而為疾病治療和藥物研發(fā)奠定理論基礎。