超表達(dá)SRD5A2基因?qū)ι窖蚵殉差w粒細(xì)胞增殖和產(chǎn)羔相關(guān)基因表達(dá)的影響

洪 磊，陳 祥，唐 文，周志楠

(貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 高原山地動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省動(dòng)物遺傳育種與繁殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

類固醇激素是動(dòng)物體內(nèi)最主要的一類性腺激素,包括雄激素、雌激素和孕酮等[1]，參與動(dòng)物的生殖調(diào)控，與動(dòng)物的繁殖性狀密切相關(guān)。類固醇5α還原酶2(steroid 5 alpha-reductase 2,SRD5A2)是微粒體蛋白，能催化睪酮轉(zhuǎn)化為二氫睪酮[2]。20世紀(jì)90年代初，ANDERSSON等[3]首先克隆了SRD5A2的2種異構(gòu)體全長(zhǎng)cDNA，分別命名為1、2型微粒體蛋白。SRD5A2基因決定著哺乳類(包括人類)胚胎生殖道原始細(xì)胞的分化和性別發(fā)育[4]。二氫睪酮結(jié)合雄激素受體后啟動(dòng)外生殖器發(fā)育，使其分化為男性型并促進(jìn)前列腺發(fā)育，若該酶缺陷會(huì)引起男性型分化障礙。研究顯示SRD5A2基因與生殖系統(tǒng)及前列腺組織發(fā)育有關(guān)[5]，SRD5A2基因缺乏，會(huì)造成女性生殖能力低下的臨床癥狀。ZI等[6]比較多羔金堂黑山羊和單羔藏羊卵巢基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況，結(jié)果顯示SRD5A2基因在多羔金堂黑山羊卵巢組織表達(dá)高于在單羔藏羊卵巢組織，推測(cè)其可能與金堂黑山羊高繁殖性能有關(guān)。ZOU等[7]對(duì)單、多羔川中黑山羊卵巢進(jìn)行RNA高通量測(cè)序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SRD5A2基因在類固醇激素生物合成中顯著富集。通過(guò)檢測(cè)SRD5A2基因?qū)ι窖虍a(chǎn)羔性狀相關(guān)基因表達(dá)量變化，有助于探究SRD5A2基因?qū)η甭檠虍a(chǎn)羔性狀的調(diào)控機(jī)制。而生長(zhǎng)因子對(duì)動(dòng)物卵泡發(fā)育有著極其重要作用，山羊繁殖相關(guān)基因包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子超家族β(TGFβ)中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)、生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白1B(BMPR-1B)，他們是卵巢中啟動(dòng)卵泡發(fā)育以及調(diào)節(jié)排卵的必要生長(zhǎng)因子[8-11]，是山羊多羔性狀候選基因。MIAO等[12]通過(guò)對(duì)濟(jì)寧青山羊和萊蕪黑山羊的卵巢RNA-Seq發(fā)現(xiàn)，miR-187和miR-874這2個(gè)miRNA可以通過(guò)調(diào)節(jié)BMPR-1B、SRD5A2等基因的表達(dá)而調(diào)控山羊的繁殖力。BMP15與GDF9基因共同作用于卵泡，影響優(yōu)勢(shì)卵泡的選擇和閉鎖卵泡的形成，調(diào)控顆粒細(xì)胞的增殖和分化。促卵泡素(FSH)是一種由垂體前葉分泌的糖蛋白激素，它與性腺細(xì)胞受體結(jié)合，促使顆粒細(xì)胞增殖，刺激類固醇合成，從而調(diào)節(jié)配子細(xì)胞的發(fā)育和成熟，F(xiàn)SH由α和β兩個(gè)亞基組成，β亞基決定著FSH的生物活性[13]。促卵泡素β亞基(FSHB)在山羊繁殖過(guò)程中起著重要作用，是山羊高繁殖性狀的主效基因。因此，SRD5A2基因是否通過(guò)影響產(chǎn)羔相關(guān)基因表達(dá)來(lái)參與調(diào)控山羊產(chǎn)羔性狀，是本研究主要目的之一。

黔北麻羊是貴州地方三大優(yōu)良山羊品種之一，具有良好的種質(zhì)特性，如遺傳性能穩(wěn)定，抗病力強(qiáng)，合群性好，適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)[14]，有較高研究?jī)r(jià)值。研究其多羔遺傳分子機(jī)制，對(duì)培育多胎黔北麻羊新品系和提高黔北麻羊養(yǎng)殖效益具有重要意義。本研究通過(guò)克隆黔北麻羊SRD5A2基因，構(gòu)建SRD5A2基因真核表達(dá)載體并培養(yǎng)黔北麻羊卵巢顆粒細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染，檢測(cè)SRD5A2基因?qū)?xì)胞增殖和產(chǎn)羔性狀相關(guān)基因表達(dá)的影響，為探究SRD5A2基因?qū)η甭檠虍a(chǎn)羔性狀調(diào)控的分子機(jī)制及提高產(chǎn)羔性能的研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)自貴州省習(xí)水縣富興牧業(yè)有限公司，選擇健康的(2～3歲)黔北麻羊經(jīng)產(chǎn)母羊6只，體質(zhì)量均勻，平均體質(zhì)量38 kg。參照貴州省地方標(biāo)準(zhǔn)《羊屠宰操作規(guī)程》(DB22/T 2740—2017)進(jìn)行屠宰，采集卵巢組織，用75%酒精沖洗3次，置于含雙抗的PBS溶液中保存，4～5 h內(nèi)進(jìn)行分離培養(yǎng)卵巢顆粒細(xì)胞及RNA提取。

1.2 主要試劑及儀器快速瓊脂糖凝膠回收試劑盒、T-克隆PCR產(chǎn)物克隆試劑盒、pMD19-T載體連接試劑盒均購(gòu)自生工生物工程技術(shù)有限公司(上海)；氨芐青霉素、TOP10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司； EcoRⅠ和BamHⅠ酶購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；TRIzol試劑購(gòu)自貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司；10×QuickCut Green Buffer購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；Hi Fi Script cDNA第1鏈合成試劑盒、高純度質(zhì)粒小提試劑盒等購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒、PBS溶液、DMEM/F12 1∶1培養(yǎng)基、胰蛋白凍等購(gòu)自廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。

1.3 相關(guān)基因的引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI上傳的山羊SRD5A2、BMP15、BMPR-1B、GDF9、FSHB基因mRNA序列，以β-actin為內(nèi)參基因，利用Primer 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)和酶切位點(diǎn)分析，在SRD5A2基因5′端添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)，由生工生物工程技術(shù)有限公司(上海)進(jìn)行合成(表1)。

表1 PCR反應(yīng)引物信息

1.4 總RNA提取及cDNA合成采用TRIzol法提取黔北麻羊的卵巢組織的總RNA，并吸取1 μL測(cè)定總RNA濃度和純度，D260/D280值為1.8～2.0，-80℃保存。按照Hi Fi Script cDNA第1鏈合成試劑盒操作步驟反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)，D260/D280值為1.7～1.9，-20℃保存。

1.5 目的片段合成及回收以cDNA為模板，進(jìn)行SRD5A2基因CDS區(qū)克隆，PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2×Es Taq Master Mix 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各 1.0 μL，無(wú)酶水5.5 μL，2 mg/L cDNA模板2.5 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，59℃退火45 s，72℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增目的產(chǎn)物。將發(fā)光較亮且長(zhǎng)度符合條帶，按照膠回收試劑盒操作步驟進(jìn)行目的片段回收，取1 μL反應(yīng)產(chǎn)物于超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)。

1.6 PCR產(chǎn)物連接與測(cè)序?qū)⒛z回收產(chǎn)物與pMD19-T載體在16℃恒溫下連接過(guò)夜。將連接液加入到TOP10感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置30 min，42℃水浴熱激90 s，再次冰上靜置20 min 后，加入不含抗生素液體培養(yǎng)基700 μL，固定于37℃培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)1 h，均勻涂布在制好的LB固體培養(yǎng)基(含有氨芐青霉素)進(jìn)行培養(yǎng)。觀察平板上菌落生長(zhǎng)情況，挑取10個(gè)白色單菌落置于含有氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)12 h，參照1.5反應(yīng)條件PCR鑒定菌液。PCR產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。挑選與目的條帶大小一致的菌液送至生工生物工程技術(shù)有限公司(上海)進(jìn)行測(cè)序。

1.7 SRD5A2基因真核表達(dá)載體構(gòu)建及驗(yàn)證對(duì)重組基因質(zhì)粒和pEGFP-N3空載體進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，使目的片段與pEGFP-N3載體具有相同的黏性末端，酶切體系如下：重組質(zhì)粒/pEGFP-N3空載體8 μL，EcoRⅠ和BamHⅠ分別1 μL，10×QuickCut Green Buffer 2 μL,ddH2O 8 μL，37℃恒溫水浴2 h。雙酶切SRD5A2基因與pEGFP-N3真核表達(dá)載體連接，反應(yīng)體系為0.2 μmol/L目的基因2.5 μL，500 mg/L pEGFP-N3載體1 μL，10×Ligation buffer 1 μL，T4DNA Ligase 0.5 μL，ddH2O 5 μL。連接過(guò)夜所得產(chǎn)物全部轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。轉(zhuǎn)化及挑菌步驟與1.6相同，雙酶切檢測(cè)，篩選陽(yáng)性菌液，并送至生工生物工程技術(shù)有限公司(上海)進(jìn)行測(cè)序。

1.8 山羊卵巢卵泡顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定參考劉曉鵬等[15]方法，將采集新鮮健康黔北麻羊卵巢用75%酒精沖洗后，用滅菌PBS沖洗3～5次，完全去除殘留的酒精后，在DMEM/F-12新鮮培養(yǎng)液中，用醫(yī)用無(wú)菌注射器針頭刺入卵巢的卵泡腔，吸取卵泡液，使卵泡液完全釋放，吸取DMEM/F-12培養(yǎng)液吹打使得卵泡液和培養(yǎng)液混合均勻。將混合液吸入至10 mL無(wú)菌離心管，靜置10 min后，將上層清液吸入到新的10 mL無(wú)菌離心管中，1 000 r/min離心10 min；棄去上清液，加入3 mL DMEM/F-12 培養(yǎng)液，輕吹混和均勻，1 000 r/min離心10 min，此步重復(fù)1次；棄去上清液，加入新配制的 DMEM/F-12培養(yǎng)液，含10%胎牛血清和1%雙抗(100 IU/mL青霉素+50 g/L鏈霉素)，輕輕吹打混勻，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放置在培養(yǎng)箱中，37℃ 5%CO2下培養(yǎng)24 h，使用滅菌的PBS沖洗2次后，更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

采用免疫熒光染色法，鑒定分離培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞純度，操作步驟參考高可心等[16]的方法。

1.9 SRD5A2基因真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染將卵巢顆粒細(xì)胞均勻分裝至6孔板中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%～90%匯合度時(shí)，更換為含10%胎牛血清且無(wú)抗生素的培養(yǎng)基，利用LipofectamineTM3000CD Reagent轉(zhuǎn)染試劑盒，按照說(shuō)明書將重組質(zhì)粒pEGFP-N3-SRD5A2與轉(zhuǎn)染試劑混合，均勻地滴加到細(xì)胞培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中37℃ 5%CO2培養(yǎng)24 h后，使用倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。

1.10 超表達(dá)SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細(xì)胞增殖的影響將細(xì)胞分裝于96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)到90%左右的匯合度，更換為含10%胎牛血清且無(wú)抗生素的培養(yǎng)基，將pEGFP-N3-SRD5A2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞，分別培養(yǎng)6，12，24，48 h后，更換100 μL新鮮培養(yǎng)基，然后再加入10 μL CCK-8試劑，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)D450值，分析超表達(dá)pEGFP-N3-SRD5A2基因?qū)?xì)胞增殖的影響。

1.11 超表達(dá)SRD5A2基因?qū)Ξa(chǎn)羔性狀相關(guān)基因表達(dá)的影響收集空白組細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pEGFP-N3-SRD5A2重組質(zhì)粒的細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞RNA，返轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR檢測(cè)山羊產(chǎn)羔性狀相關(guān)基因SRD5A2、BMP15、BMPR-1B、GDF9、FSHB的mRNA在兩組細(xì)胞中的表達(dá)量。

1.12 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析采用2-△△Ct法計(jì)算，利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 黔北麻羊SRD5A2基因的克隆與測(cè)序利用卵巢組織反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增黔北麻羊SRD5A2基因CDS區(qū)，PCR結(jié)果如圖1所示，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰度高、特異性強(qiáng)，未發(fā)現(xiàn)有引物二聚體，片段長(zhǎng)度與預(yù)期片段大小723 bp一致。將擴(kuò)增的CDS區(qū)序列與pMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliTOP10中，挑選菌落進(jìn)行搖菌與測(cè)序。測(cè)序結(jié)果比對(duì)顯示，黔北麻羊SRD5A2基因與NCBI登錄的山羊相應(yīng)序列具有高度同源性，同源性達(dá)到100%，說(shuō)明已經(jīng)成功構(gòu)建黔北麻羊SRD5A2基因T克隆載體。

M.DL5000 DNA Marker;1～2.SRD5A2基因擴(kuò)增片段

2.2 山羊卵巢顆粒細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定由于FSHR在其他卵泡細(xì)胞中不表達(dá)，在卵巢顆粒細(xì)胞中專一性表達(dá)，因此，利用FSHR免疫熒光法鑒定分離培養(yǎng)的卵巢顆粒細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果顯示，加入FSHR抗體的陽(yáng)性細(xì)胞發(fā)出紅光，表明細(xì)胞分泌的FSHR蛋白與FSHR抗體結(jié)合(圖2A)，卵巢顆粒細(xì)胞的細(xì)胞核經(jīng)DAPI染色呈現(xiàn)藍(lán)色(圖2B)，細(xì)胞核染色和細(xì)胞質(zhì)染色完全重合(圖2C)，說(shuō)明山羊卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)鑒定成功，經(jīng)鑒定細(xì)胞純度高于90%，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

A.FSHR染色；B.DAPI染色；C.A+B合成圖

2.3 黔北麻羊SRD5A2真核表達(dá)載體的構(gòu)建及細(xì)胞水平的檢測(cè)重組載體pEGFP-N3-SRD5A2經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切，獲得約4 692 ,723 bp 2個(gè)條帶，分別為pEGFP-N3載體和SRD5A2基因CDS區(qū)片段，表明真核表達(dá)載體構(gòu)建成功(圖3)。將pEGFP-N3-SRD5A2重組質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測(cè)序，結(jié)果顯示，黔北麻羊SRD5A2基因與NCBI上傳的山羊SRD5A2基因的序列完全吻合。將重組質(zhì)粒pEGFP-N3-SRD5A2轉(zhuǎn)染到卵巢顆粒細(xì)胞中，24 h后在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的細(xì)胞在熒光顯微鏡下可觀察到明顯的綠色熒光，陰性對(duì)照組細(xì)胞未見有綠色熒光(圖4)。

1,2.重組載體；M.DL5000 DNA Marker

A.空白對(duì)照組;B.N3空載體組;C.SRD5A2基因超表達(dá)組

2.4 超表達(dá)SRD5A2基因轉(zhuǎn)染效率檢測(cè)超表達(dá)SRD5A2基因后，RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示(圖5)，轉(zhuǎn)染組SRD5A2基因mRNA水平極顯著高表達(dá)于空白組(P<0.01),說(shuō)明pEGFP-N3-SRD5A2真核表達(dá)載體可以顯著提高SRD5A2基因表達(dá)，SRD5A2基因超表達(dá)載體構(gòu)建并轉(zhuǎn)染成功,可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

2.5 超表達(dá)SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細(xì)胞增殖的影響CCK-8檢測(cè)結(jié)果由圖6可知，超表達(dá)SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細(xì)胞增殖均具有促進(jìn)作用，在6,12,24 h顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)，48 h 達(dá)到極顯著促進(jìn)作用(P<0.01),初步證明SRD5A2基因能促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖。

2.6 超表達(dá)SRD5A2基因?qū)ι窖虍a(chǎn)羔性狀相關(guān)基因的影響轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒成功組細(xì)胞BMPR-1B、BMP15和FSHB基因的mRNA表達(dá)水平極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，GDF9基因mRNA表達(dá)水平顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)果表明,超表達(dá)SRD5A2基因可促進(jìn)產(chǎn)羔相關(guān)基因BMPR-1B、BMP15、GDF9、FSHB在黔北麻羊卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)(圖7)。

注：*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。下同

圖6 超表達(dá)SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細(xì)胞增殖的影響

圖7 超表達(dá)SRD5A2基因?qū)Ξa(chǎn)羔性狀相關(guān)基因的表達(dá)影響

3 討論

SRD5A是一種位于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白質(zhì)，能催化睪酮轉(zhuǎn)化為另一種雄激素—二氫睪酮(DHT)，在性分化及雄激素生理中發(fā)揮重要作用。目前已知，在人類和大鼠體內(nèi)，至少存在2種5α-還原酶，即5α-還原酶1型和2型。研究顯示SRD5A2基因參與調(diào)控哺乳類(包括人類)胚胎生殖道原始細(xì)胞的分化和發(fā)育性別，與動(dòng)物繁殖密切相關(guān)。為了闡明SRD5A2基因在黔北麻羊產(chǎn)羔性能中的具體調(diào)控機(jī)制，本研究成功分離培養(yǎng)了黔北麻羊卵巢顆粒細(xì)胞，并構(gòu)建pEGFP-N3-SRD5A2真核表達(dá)載體，進(jìn)一步將載體轉(zhuǎn)染至黔北麻羊卵巢顆粒細(xì)胞中，為后續(xù)研究該基因在卵巢顆粒細(xì)胞中的功能提供理想的試驗(yàn)材料。細(xì)胞增殖是生活細(xì)胞的重要生理功能之一，是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖以及遺傳的基礎(chǔ)。研究發(fā)現(xiàn)抑制SRD5A2基因表達(dá)可以降低前列腺癌細(xì)胞增殖，說(shuō)明該基因?qū)η傲邢侔┘?xì)胞增殖具有促進(jìn)作用[17]。超表達(dá)SRD5A2基因?qū)β殉差w粒細(xì)胞在6～48 h的增殖均具有促進(jìn)作用，初步證明SRD5A2基因能促進(jìn)黔北麻羊卵巢顆粒細(xì)胞的增殖。

產(chǎn)羔數(shù)是山羊重要的繁殖性狀之一，受到多基因的調(diào)控。多羔候選基因BMPR-1B、BMP15、GDF9和FSHB等與羊產(chǎn)羔數(shù)存在一定的關(guān)聯(lián)。本試驗(yàn)進(jìn)一步研究超表達(dá)SRD5A2基因?qū)η甭檠蚵殉差w粒細(xì)胞中產(chǎn)羔相關(guān)基因表達(dá)的影響。GOYAL等[18]研究結(jié)果表明，BMPR-1B、BMP15和GDF9在綿羊黃體期卵巢中均高表達(dá)，在其他組織中也存在不同程度表達(dá)，說(shuō)明這3個(gè)基因具有廣泛生物學(xué)功能并在卵巢中發(fā)揮重要作用。BMPR-1B基因在綿羊卵巢中的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中特異性表達(dá)，影響顆粒細(xì)胞分化和卵泡發(fā)育，具有促進(jìn)排卵的作用[19]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，超表達(dá)SRD5A2基因后，BMPR-1B基因在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)顯著提高(P<0.01)，推測(cè)SRD5A2基因可能通過(guò)促進(jìn)BMPR-1B基因在卵巢顆粒細(xì)胞中的表達(dá)來(lái)促進(jìn)排卵，從而影響黔北麻羊產(chǎn)羔性狀。BMP15是豬、牛、羊的多胎候選基因[20-22]。劉霜等[23]研究發(fā)現(xiàn)，BMP15基因在多羔金堂黑山羊卵巢中的mRNA表達(dá)量高于單羔藏山羊(P<0.05)，說(shuō)明卵巢中BMP15基因的表達(dá)量與金堂黑山羊多羔性狀相關(guān)。相同的，CUI等[24]在單羔云嶺黑山羊與多羔波爾山羊的比較研究中也發(fā)現(xiàn)，波爾山羊卵巢BMP15基因的表達(dá)量顯著高于云嶺黑山羊。GDF9基因是另一種影響綿羊多胎性的基因[25]，主要由卵母細(xì)胞分泌，對(duì)卵泡的生長(zhǎng)和分化、胚胎的發(fā)育起重要的調(diào)節(jié)作用。研究發(fā)現(xiàn)，高產(chǎn)的湖羊卵泡中的GDF9基因表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)的湖羊群體[26]。FSH和促黃體素(LH)都是糖蛋白類促性腺激素[27]，是控制哺乳動(dòng)物生殖的核心激素，由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞合成和分泌。劉建斌等[28]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SHB基因可能是影響小尾寒羊高繁殖性能的一個(gè)主效基因。同樣，ZI等[29]研究報(bào)道，發(fā)情期高繁殖力樂(lè)至黑山羊腦垂體中FSHB基因的mRNA表達(dá)量顯著高于低繁殖力藏山羊。本研究RT-qPCR結(jié)果顯示，超表達(dá)SRD5A2基因后，BMPR-1B、BMP15、GDF9、FSHB基因的表達(dá)量均顯著或極顯著高于空白對(duì)照組。因此，結(jié)合前人研究結(jié)果，推測(cè)SRD5A2基因可能通過(guò)促進(jìn)產(chǎn)羔相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)參與調(diào)控產(chǎn)羔數(shù)量，進(jìn)一步證明了SRD5A2基因與黔北麻羊產(chǎn)羔性狀密切相關(guān)，具體的調(diào)控機(jī)制還有待深入研究。