XTEN修飾延長(zhǎng)多肽藥物半衰期研究進(jìn)展

于 爽，張 營(yíng)，許祺珺，裴志花,2*，馬紅霞

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省新獸藥研發(fā)與創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118；3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，吉林 長(zhǎng)春 130118；4.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118)

隨著生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，多肽藥物已成為藥物研發(fā)和臨床治療的熱點(diǎn)。目前已上市或進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段的多肽藥物已達(dá)數(shù)百種，涉及的病癥也超過200種[1]。多肽藥物具有生物活性高、低毒、低免疫原性、高組織滲透性和易于合成等優(yōu)點(diǎn)，具有極為廣泛的應(yīng)用前景。然而，大多數(shù)多肽的相對(duì)分子質(zhì)量較小，易被血液和腎臟快速清除，同時(shí)易被人和動(dòng)物體內(nèi)的多種蛋白酶和肽酶降解，因此大多數(shù)多肽類藥物的體內(nèi)半衰期較短，這嚴(yán)重限制了該類藥物在臨床上的應(yīng)用[2]。為了解決多肽藥物半衰期短的問題，近年來研究者利用DNA融合技術(shù)將多肽藥物與其他蛋白融合、糖基化或與聚合物綴合等，增加了蛋白質(zhì)的流體動(dòng)力學(xué)體積或產(chǎn)生電荷效應(yīng)，通過減小腎小球?yàn)V過率來延長(zhǎng)多肽藥物的半衰期，并取得了一定的成效[3]。在多肽藥物與聚合物綴合來延長(zhǎng)藥物半衰期的研究中報(bào)道最多的是PEG化學(xué)修飾、PAS 綴合和XTEN修飾。XTEN修飾技術(shù)是近年來新興的一種用于延長(zhǎng)藥物半衰期、增加藥物穩(wěn)定性的蛋白及多肽藥物修飾技術(shù)，具有極為廣闊的應(yīng)用前景?，F(xiàn)就XTEN蛋白修飾技術(shù)在延長(zhǎng)多肽藥物半衰期方面的研究做一總結(jié)，以期為多肽藥物半衰期延長(zhǎng)策略的研究提供理論依據(jù)。

1 XTEN蛋白修飾技術(shù)

1.1 XTEN蛋白序列XTEN是一條含有864個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)聚合物，該聚合物及其不同長(zhǎng)度的衍生物統(tǒng)稱為XTEN。XTEN最初是Amunix公司[5]開發(fā)的一類非結(jié)構(gòu)化的可生物降解的蛋白質(zhì)聚合物，是一段由6個(gè)親水、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定的氨基酸組成的非重復(fù)性氨基酸序列。VOLKER等[4]嘗試用以上6個(gè)氨基酸以不同比例組合成序列片段，在大腸桿菌中成功表達(dá)，并通過常規(guī)蛋白質(zhì)色譜法純化為具有確切長(zhǎng)度和序列的單分散多肽[5]。XTEN具有親水性高和免疫原性低的特點(diǎn)[6]，有較大的流體動(dòng)力學(xué)體積且?guī)ж?fù)電荷，通過基因工程方法將多肽藥物與XTEN融合，能夠增強(qiáng)藥物的穩(wěn)定性和溶解性。非結(jié)構(gòu)化XTEN多肽流體力學(xué)體積比類似質(zhì)量的典型球狀蛋白大得多，因此賦予與其連接的多肽藥物以流體力學(xué)體積增大的效應(yīng)，進(jìn)而達(dá)到增強(qiáng)多肽藥物的穩(wěn)定性、溶解性及體內(nèi)半衰期的目的。

1.2 XTEN序列的設(shè)計(jì)NATHAN等[5]發(fā)現(xiàn)了一個(gè)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的多肽鏈可以形成類似于PEG的擴(kuò)展構(gòu)象，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)非結(jié)構(gòu)性蛋白序列XTEN能夠提供體積增大效應(yīng)，從而能穩(wěn)定與之融合的蛋白質(zhì)，并可能降低蛋白類藥物的免疫原性。XTEN蛋白修飾不僅能夠比聚乙二醇化修飾獲得更均勻的最終產(chǎn)物，還能避免在修飾過程中發(fā)生化學(xué)偶聯(lián)，而且可以精確地將修飾的多肽調(diào)整到任何期望長(zhǎng)度，以控制血漿半衰期。

為了設(shè)計(jì)一種可溶的、化學(xué)穩(wěn)定的、主要是非結(jié)構(gòu)化的多肽，研究人員首先排除了疏水性氨基酸Phe、Ile、Leu、Met、Val、Trp和Tyr，因?yàn)樗鼈円讓?dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，且易引起HLA/MHL-Ⅱ介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。然后排除了帶酰胺基團(tuán)的氨基酸Asn和Gln，因?yàn)槠浠瘜W(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定、易水解。接下來又排除了帶正電荷的氨基酸His、Lys和Arg，因?yàn)樗鼈儠?huì)與細(xì)胞膜相互作用。最后排除了易形成二硫鍵的氨基酸Cys。ALVAREZ等[7]曾嘗試使用2～5個(gè)氨基酸的5肽重復(fù)序列來設(shè)計(jì)非結(jié)構(gòu)氨基酸序列，結(jié)果顯示出免疫原性和很低的溶解度，而血漿半衰期僅得到適度改善，這意味著需要額外的氨基酸來獲得具有理想性質(zhì)的蛋白聚合物?；谶@些考慮，最終研究人員選擇了Pro、Glu、Ser、Thr、Ala和Gly 等6種氨基酸，成功降低了免疫原性并增加了溶解度。研究人員[5-7]為了創(chuàng)建沒有固定二級(jí)結(jié)構(gòu)并能在大腸桿菌中穩(wěn)定、高效表達(dá)的多肽，首先構(gòu)建了1個(gè)包含以上6種氨基酸的36個(gè)非重復(fù)性的氨基酸片段庫(每個(gè)片段包含8%A、12%E、18%G、17%P、28%S和17%T)，并從中篩選出約1 500個(gè)高效表達(dá)水平的獨(dú)特片段。對(duì)這些高效表達(dá)的片段進(jìn)行反復(fù)連接并重新篩選以獲得最大表達(dá)，得到一個(gè)片段庫，其中的每個(gè)片段包含864個(gè)氨基酸。然后對(duì)其中5個(gè)表達(dá)量最高的片段進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性、溶解度、熱穩(wěn)定性、抗聚集性和污染物分布(包括宿主細(xì)胞蛋白質(zhì)、DNA和細(xì)菌脂多糖)等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)估(數(shù)據(jù)未顯示)，選擇出了一個(gè)名為XTEN的序列，進(jìn)行進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其性質(zhì)穩(wěn)定，表達(dá)水平高。如今，該多肽及其不同長(zhǎng)度的衍生物統(tǒng)稱為XTEN[7]。

2 XTEN蛋白修飾技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

2.1 多重機(jī)制延長(zhǎng)多肽藥物半衰期腎小球的濾過率與多肽藥物的大小和電荷數(shù)有關(guān)。XTEN攜帶谷氨酸殘基使融合蛋白帶有大量負(fù)電荷，這會(huì)降低其與受體之間的親和力，從而減少受體介導(dǎo)的蛋白藥物的清除。另外，XTEN多肽攜帶大量負(fù)電荷，與基底膜之間發(fā)生靜電排斥作用，也可以減慢腎小球的濾過作用，可進(jìn)一步延長(zhǎng)蛋白藥物的血漿半衰期。并且XTEN是無規(guī)則卷曲構(gòu)象的蛋白質(zhì)，這使得多肽融合蛋白具有較大的流體動(dòng)力學(xué)體積，從而減少腎小球?qū)λ幬锏臑V過作用[8]，從而達(dá)到延長(zhǎng)多肽藥物半衰期的目的。

2.2 融合產(chǎn)物易于表達(dá)和純化融合構(gòu)建體的一個(gè)明顯好處是便于表達(dá)、純化和表征單個(gè)分子，該單個(gè)分子包括治療藥物部分和填充部分。為了適應(yīng)遺傳融合，有效載荷分子必須由蛋白源性L-氨基酸組成，并且融合產(chǎn)物必須是線性單向多肽[9]。由于XTEN蛋白聚合物經(jīng)過工程改造，有非常高的溶解度，因此生成的融合產(chǎn)物可以方便地以可溶形式在胞質(zhì)溶膠中表達(dá)。根據(jù)菌株的遺傳因素和所使用的表達(dá)載體，可以利用T7/lac或phoA啟動(dòng)子系統(tǒng)來優(yōu)化產(chǎn)物的表達(dá)[10]。XTEN融合產(chǎn)物通常顯示出可增強(qiáng)所修飾目的肽和目的蛋白溶解度和熱力學(xué)穩(wěn)定性的特點(diǎn)[11]，有助于獲得可溶性表達(dá)的目的蛋白和目的蛋白的純化產(chǎn)物。

2.3 XTEN蛋白修飾有望取代PEG修飾聚乙二醇(PEG)是歷史上第一種通常用于提高生物治療劑體內(nèi)半衰期的填充劑，現(xiàn)已被應(yīng)用在多種已獲批準(zhǔn)的產(chǎn)品中[12-14]。PEG修飾有降低免疫原性、增加藥物溶解性、減少蛋白酶降解、增加藥物流體動(dòng)力學(xué)體積等優(yōu)點(diǎn)，但是仍存在純化工藝復(fù)雜、成本高、長(zhǎng)期給藥時(shí)易產(chǎn)生抗PEG的抗體、會(huì)在腎臟中聚集等缺點(diǎn)。PEG不可生物降解，在動(dòng)物研究中已觀察到PEG化修飾化合物的細(xì)胞空泡[15-16]。盡管人們普遍認(rèn)為PEG本身不具有免疫原性的，但據(jù)報(bào)道PEG化治療劑的免疫原性似乎取決于被修飾蛋白質(zhì)大小、PEG大小和化學(xué)組成。在用PEG化蛋白治療的患者中檢測(cè)到的抗PEG抗體的特異性和中和特性仍有爭(zhēng)議，在健康人群中也有抗PEG抗體的報(bào)道[17]。PEG的成功和局限性都刺激了替代性可生物降解填充劑的開發(fā)(表1)。

與PEG修飾相比較，XTEN蛋白修飾技術(shù)具有以下幾點(diǎn)優(yōu)勢(shì):XTEN聚合物是在標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)平臺(tái)中生產(chǎn)的，XTEN已經(jīng)在該平臺(tái)中表達(dá)并且優(yōu)化后生產(chǎn)[18]，隨后的XTEN純化處理是高效且易于擴(kuò)展的，產(chǎn)生了均勻的、高度純化的本體[19]。XTEN蛋白聚合物具有較高的生物安全性，它能進(jìn)行生物降解，不會(huì)在器官或細(xì)胞中蓄積，避免產(chǎn)生副作用；可以通過基因工程技術(shù)將XTEN和蛋白質(zhì)進(jìn)行融合表達(dá)，從而避免了體外化學(xué)偶聯(lián)和修飾后的純化、去除標(biāo)簽等步驟；融合蛋白的半衰期可通過調(diào)整多肽鏈的長(zhǎng)度來調(diào)節(jié)，可以為臨床用藥提供選擇，連接于蛋白藥物的N端還是C端對(duì)于其生物活性的影響是可有可無的[20]；盡管XTEN具有大量的負(fù)電荷和體積，但對(duì)于不同大小和電荷的肽，接合反應(yīng)通常進(jìn)行得迅速而有效，這表明XTEN的物理化學(xué)特性不會(huì)導(dǎo)致聚合物上活性部分的屏蔽，也不會(huì)導(dǎo)致XTEN與目標(biāo)肽之間產(chǎn)生非生產(chǎn)性的排斥或吸引作用[20]，且使用范圍廣[21]。除了PEG修飾外，還有其他延長(zhǎng)半衰期的重組方法包括融合免疫球蛋白、抗體衍生片段、以及白蛋白或結(jié)合血漿中長(zhǎng)壽命分子的結(jié)構(gòu)域等技術(shù)，都有自己的優(yōu)勢(shì)，但是XTEN適用于更廣泛的藥物種類，原核和真核系統(tǒng)都可用于表達(dá)XTEN融合蛋白，因此XTEN修飾技術(shù)有望替代PEG修飾，在肽類和蛋白質(zhì)類藥物半衰期延長(zhǎng)方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

表1 XTEN蛋白融合與PEG修飾的比較

3 XTEN蛋白修飾技術(shù)在藥物半衰期延長(zhǎng)方面的應(yīng)用

XTEN蛋白修飾技術(shù)可以通過融合表達(dá)和化學(xué)偶聯(lián)2種方法來延長(zhǎng)多肽藥物的半衰期?；瘜W(xué)偶聯(lián)法需要分別生產(chǎn)XTEN和有效藥物載荷、組分選擇性交聯(lián)以及最終結(jié)合物的純化，這些額外的步驟較多而且麻煩。與化學(xué)偶聯(lián)相比，XTEN融合蛋白通常易于表達(dá)，但仍需要對(duì)其表達(dá)和純化步驟進(jìn)行一些探索。利用基因融合產(chǎn)生XTEN蛋白的一個(gè)功能優(yōu)勢(shì)是能夠?qū)⒍鄠€(gè)XTEN片段融合到感興趣的治療蛋白上，這一優(yōu)勢(shì)已提高和開發(fā)了幾種藥物的治療能力[22]。在人生長(zhǎng)激素(hGH)中，通過將XTEN的912個(gè)氨基酸殘基序列融合到治療蛋白的N端，使腎臟清除率最小化，而通過將XTEN的144個(gè)氨基酸殘基序列融合到C末端，可以降低受體介導(dǎo)的清除率[23]。在凝血因子Ⅷ中，多個(gè)XTEN片段被整合到多肽藥物的天然序列中[24]。XTEN蛋白聚合物由基因編碼的氨基酸組成，因此可以重組融合到治療性蛋白質(zhì)或肽上[25]。目前，XTEN技術(shù)已應(yīng)用在包括激素、凝血因子和多肽在內(nèi)的多種生物治療方法中。

3.1 XTEN與hGH融合腎臟過濾和受體介導(dǎo)的清除作用會(huì)清除人體內(nèi)的生長(zhǎng)激素，從而導(dǎo)致該藥物在猴子中的半衰期為2～3 h[26-29]。VRS-317是一種新型的長(zhǎng)效hGH-XTEN融合蛋白，正在臨床研發(fā)中，用于治療生長(zhǎng)激素缺乏癥(GHD)，經(jīng)過專門設(shè)計(jì)的藥物可包含這種雙重清除抑制機(jī)制，從而延長(zhǎng)藥物在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期[23](大鼠延長(zhǎng)至15 h，猴子延長(zhǎng)至110 h)。VRS-317的臨床評(píng)估于2012年在50名GHD成人中開始。在這項(xiàng)單次遞增劑量研究中，發(fā)現(xiàn)VRS-317是有效的，耐受性良好，沒有意外或嚴(yán)重的不良事件，確定其半衰期為131 h，這表明VRS-317是潛在的按月劑量進(jìn)行治療的良好藥物[30]。

3.2 XTEN與艾塞那肽融合艾塞那肽是一種39個(gè)氨基酸的肽，其作用類似于胰高血糖素樣肽1(GLP-1)，目前以byetta的形式出售以治療T2D(2型糖尿病)。由于其體積小且腎臟清除迅速，byetta的血漿半衰期為2.4 h，每天需用藥2次。byetta治療最常見的副作用是惡心、嘔吐和腹瀉[31]。2012年，byetta的緩釋版本bydureon被FDA批準(zhǔn)為首個(gè)每周1次用于治療T2D的藥物。然而，bydureon的注射部位結(jié)節(jié)發(fā)病率很高[32]。為了延長(zhǎng)艾塞那肽的循環(huán)半衰期，將XTEN與該肽的C末端融合，融合分子被稱為VRS-859[5]。VRS-859已在動(dòng)物模型中進(jìn)行了廣泛測(cè)試，根據(jù)在小鼠、大鼠、猴和犬中確定的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，預(yù)計(jì)在人體內(nèi)的半衰期為139 h[23]。

3.3 XTEN與胰高血糖素樣肽2融合teduglutide在美國(guó)以gattex的名義出售，在歐洲以revestive的名義出售，是一種胰高血糖素樣肽2(GLP2)類似物，適用于治療患有節(jié)段性回腸炎疾病。與天然GLP2相比，teduglutide(GLP2-2G)在第2位具有甘氨酸取代基，增加了其半衰期和穩(wěn)定性，從而將人的半衰期從7 min延長(zhǎng)至3～5 h[33-35]。即使在循環(huán)半衰期有所增加的情況下，仍需每天服用teduglutide。這時(shí)長(zhǎng)效GLP2-2G-XTEN有更高的療效以及更少的給藥頻率。GLP2-2G-XTEN是通過GLP2-2G肽在其C端與864個(gè)氨基酸長(zhǎng)XTEN遺傳融合而產(chǎn)生的。在小鼠、大鼠和猴中，GLP2-2G-XTEN血漿半衰期分別顯著延長(zhǎng)至34，38,120 h。根據(jù)異速生長(zhǎng)比例，估計(jì)在人體內(nèi)的半衰期為240 h[16]。

3.4 XTEN與胰高血糖素融合低血糖癥是糖尿病治療中最常見的并發(fā)癥，影響90%的糖尿病人群，嚴(yán)重低血糖癥患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)會(huì)增加[36-37]。Gcg是一種能夠?qū)⒏翁窃鎯?chǔ)量轉(zhuǎn)化為葡萄糖以釋放到血液中的肽激素，通常在這種急性降血糖危機(jī)的情況下使用。由于其在液體制劑中的溶解性和穩(wěn)定性差，目前市場(chǎng)上銷售的Gcg為凍干粉，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。天然Gcg的半衰期非常短，為8～18 min[38]，因此不適合在夜間低血糖癥中預(yù)防使用[39-40]。由于XTEN蛋白聚合物能夠改善多肽的溶解度、穩(wěn)定性和半衰期，因此由XTEN修飾的Gcg可用于夜間低血糖預(yù)防性治療。XTEN144-Gcg是通過將144個(gè)氨基酸長(zhǎng)的XTEN重組融合到Gcg的C端而產(chǎn)生的。Gcg-XTEN144的溶解度比天然胰高血糖素高60倍，可以進(jìn)行液體配制。在禁食的比格犬模型中，發(fā)現(xiàn)Gcg-XTEN144和天然Gcg均可引起血糖快速升高。但只有Gcg-XTEN144的作用持續(xù)了10～12 h，而Gcg的作用在2 h后恢復(fù)[6]。這些數(shù)據(jù)表明，Gcg-XTEN144有潛力成為預(yù)防夜間低血糖的有效藥物療法。

3.5 XTEN與凝血因子融合血友病a和b分別是由凝血因子Ⅷ(FⅧ)和凝血因子Ⅸ(FⅨ)活性不足引起的遺傳性出血性疾病。血友病的標(biāo)準(zhǔn)治療方法是通過定期輸注血漿來源的FⅧ/FⅨ或重組FⅧ/FⅨ來替代缺失的凝血因子，在血液中保持一定的凝結(jié)活性以防止出血[39-40]。此方案的臨床結(jié)果顯著改善，但由于這些凝血因子的半衰期短，導(dǎo)致了很高的治療費(fèi)用，因此需要延長(zhǎng)其血漿半衰期。將FⅦ與288個(gè)氨基酸的XTEN的C端連接并表達(dá)出蛋白，通過常規(guī)色譜方法純化[41-42]，評(píng)估血友病a小鼠單次靜脈內(nèi)輸注后不同時(shí)間點(diǎn)的可溶性組織因子凝血酶原時(shí)間活性來確定藥代動(dòng)力學(xué)，還觀察到終末半衰期顯著延長(zhǎng)(從1.2 h延長(zhǎng)至8.9 h)[43]，以及在藥代動(dòng)力學(xué)曲線下的回收率和面積顯著增加(表2)。

這些結(jié)果證明XTEN蛋白融合可以成功應(yīng)用于復(fù)雜生物制劑，融合表達(dá)是一種可行的方式并顯著延長(zhǎng)多肽藥物的半衰期以及改善藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

4 總結(jié)與展望

XTEN蛋白修飾結(jié)合了聚合物理想的物理化學(xué)性質(zhì)和DNA編碼蛋白質(zhì)合成的精確性，其設(shè)計(jì)是專門用于模仿PEG的有益特性，同時(shí)避免了其某些缺點(diǎn)，例如具有免疫原性和缺乏生物降解性[47]。XTEN與多肽藥物的融合導(dǎo)致其半衰期比原肽延長(zhǎng)了60～130倍，此外還提高了其熱穩(wěn)定性和溶解性。但與所有延長(zhǎng)藥物半衰期的方法一樣，XTEN蛋白修飾技術(shù)也具有一些缺點(diǎn)和不足，比如： XTEN及其修飾的多肽都必須由天然L-氨基酸組成，融合蛋白以線性單向多肽的形式產(chǎn)生，修飾后表達(dá)系統(tǒng)和純化步驟等還有待探索和優(yōu)化。然而，隨著XTEN修飾技術(shù)研究的不斷深入，這些缺點(diǎn)和不足必將得到克服。XTEN修飾已不限于XTEN蛋白與目的肽和蛋白質(zhì)的末端融合，XTEN還可以在體外與其他類型的生物活性分子共價(jià)化學(xué)偶聯(lián)，這樣既可以將反應(yīng)性基團(tuán)放置在XTEN序列內(nèi)的受控位置，也可以放置在其他附著位置。XTEN不僅可以作為一種可生物降解的填充劑，而且可以作為一個(gè)組裝平臺(tái)，將靶向部分和細(xì)胞毒性因子等多種功能結(jié)合到新的治療方法中，用于更多的臨床適應(yīng)癥。目前一些融合蛋白產(chǎn)物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段，如VRS-859、VRS-317等，隨著研究的不斷深入， XTEN蛋白修飾技術(shù)必將成為延長(zhǎng)蛋白質(zhì)和多肽藥物半衰期不可或缺的有效手段，從而促進(jìn)這類藥物的臨床應(yīng)用。

表2 XTEN修飾多肽藥物與原藥的半衰期