大鼠70%肝缺血再灌注(IRI)合并部分肝切除對機體氧化應激和炎癥反應的影響

徐嘉元，張千振，樸晨曦，王 月，劉 濤，張建濤，王洪斌

(1.東北農業(yè)大學 動物醫(yī)學院 黑龍江省普通高等學校動物普通疾病防治重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

缺血再灌注損傷(IRI)是一種引起機體一系列復雜反應導致細胞損傷的病理生理現(xiàn)象，包括缺血損傷和炎癥介導的再灌注損傷的動態(tài)過程。與其他器官不同，肝臟是機體唯一涉及門靜脈和肝動脈的雙重供血臟器，對缺血再灌注損傷極不耐受。肝臟缺血再灌注損傷(HIRI)多發(fā)于肝腫瘤切除、嚴重創(chuàng)傷或器官移植、血管重建等肝血流阻斷后，導致肝功能衰竭及遠隔器官損傷[1-2]。研究表明，在IRI損傷中，缺血期間由于代謝紊亂引起線粒體失調，導致肝細胞損傷。再灌注期間，功能失調的組織產生活性氧(ROS)和有毒代謝物誘導氧化應激，參與激活局部或全身凋亡介質和炎癥級聯(lián)反應[3]。如何提高肝IRI合并部分肝切除術的成功率和生存率，是近年來臨床醫(yī)學上比較重視的問題。目前，對于肝IRI合并肝切除的動物研究模型大部分局限于全肝或部分肝葉Pringle法[4]進行缺血，于再灌注后行肝葉切除。因此，本研究建立更貼近于臨床的70%肝IRI合并部分肝切除模型進行模擬臨床上的不規(guī)則肝切除、肝移植等手術，并檢測機體氧化應激及炎癥反應的變化，分析該模型對機體損傷的影響，為探討肝IRI合并部分肝切除損傷的發(fā)病機制和保護性研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物清潔級健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，6～7周齡，選用體質量200～250 g的大鼠進行造模，購自遼寧長生生物技術股份有限公司。分籠飼養(yǎng)于12 h晝夜交替、溫度及濕度適宜的動物房，給予SPF級大小鼠維持飼料，自由飲水。

1.2 主要設備與試劑呼吸麻醉系統(tǒng)，美國小動物醫(yī)療器械公司生產；Epoch酶標儀，美國BioTek公司生產；異氟烷，河北一品制藥有限公司生產；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-10(IL-10)酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)測定試劑盒均購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 大鼠70%肝IRI合并30%部分肝切除模型的建立及分組將48只雄性SD大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后隨機分為2組，假手術組(Sham組)、模型組(70%IRI+30%PH)，每組24只。假手術組沿大鼠腹正中線切開，暴露肝臟，不行血管阻斷及部分肝葉切除，僅用棉簽翻動肝葉，然后關腹。模型組行70%部分肝(肝中葉+左外葉)缺血30 min，于再灌注前切除左外葉(占全肝的30%)。術前禁食8～12 h，不禁水。將大鼠放置于麻醉誘導盒中，連接呼吸麻醉導聯(lián)系統(tǒng)行異氟烷呼吸麻醉，仰臥位保定，腹部備皮，消毒，鋪設創(chuàng)巾。

麻醉成功后，自劍狀軟骨向下沿正中腹白線做長4～5 cm的切口，逐層進腹，用濕棉簽探查肝臟，充分暴露肝門，游離肝周韌帶，按照順序分別游離鐮狀韌帶、肝胃韌帶、肝圓韌帶，用顯微彎鑷鈍性分離肝中葉、左葉的Glisson系統(tǒng)(包括門靜脈分支、肝動脈及膽管)[5]。將無損傷微血管夾放置在下腔靜脈和門靜脈之間，阻斷肝中葉、左葉的血流，誘導70%肝臟缺血。此時可見肝中葉、左葉呈灰白色，證明缺血成功。阻斷血供期間右葉和尾狀葉門靜脈及動脈血供保留，預防腸道淤血。再灌注前切除左外葉，切除前用3 cm直無損傷血管夾夾閉左外葉根部作為預切線，防止結扎肝中左葉血供，造成再灌注后血供恢復不完全。用3-0號絲線沿無損傷微血管夾上端行左外葉結扎，切除。松開夾閉無損傷微血管夾，觀察肝葉顏色由灰白色變?yōu)轷r紅色，證明血液恢復。溫生理鹽水沖洗腹腔后，常規(guī)逐層閉合腹腔。

1.4 樣本采集及指標檢測

1.4.1樣本采集及處理 各組大鼠分別于再灌注6，24，72，168 h后經心臟采血，抽取10 mL血液樣本置真空采血管中，室溫下靜置約15 min后，常溫低速離心機3 500 r/min離心15 min，將血清分裝于1.5 mL離心管中，保存于-80℃冰箱用于后續(xù)實驗室檢測。

1.4.2肝功能檢測 取各組6，24，72，168 h血清樣本，按照AST試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀在相應波長檢測。

1.4.3血清氧化應激反應指標的檢測 檢測前取出各分組凍存于-80℃的血清樣本，分別按照GSH-Px、SOD、MDA商品化試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀在相應波長檢測各時間點指標的含量。

1.4.4血清炎癥反應相關指標的檢測 檢測前取出各分組凍存于-80℃的血清樣本，分別按照TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10 ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測各時間點的含量。

2 結果

2.1 大鼠70%肝IRI損傷合并30%部分肝切除模型的建立在本研究中，大鼠模型為研究小體積肝移植術、肝腫瘤切除術及不規(guī)則肝切除術后肝IRI損傷提供了更貼近臨床醫(yī)學的動物模型，為防止出現(xiàn)腸道充血，采用高精準性分離并夾閉肝中葉和左外葉門靜脈分支、肝動脈及膽管。再灌注前行肝左外葉切除術，恢復血供，模擬臨床中小體積肝移植術、肝腫瘤切除術及不規(guī)則肝切除術等，以研究IRI后的肝功能。結果表明，再灌注前15 min行肝左外葉切除術可模擬臨床中小體積肝移植術、精準肝切除術及不規(guī)則肝切除術等(圖1)。

圖1 大鼠70%肝IRI合并部分肝切除模型操作示意圖

手術具體操作步驟：高精準分離并夾閉肝中葉和左外葉Glisson系統(tǒng)(圖2A)，成功建立70%肝缺血模型(圖2B)，再灌注前行肝左外葉切除，保留肝中葉并恢復血供(圖2C)，常規(guī)閉合腹腔。

圖2 大鼠70%肝IRI合并部分肝損傷模型試驗

2.2 肝損傷大鼠血清中AST水平的變化假手術組AST再灌注后6 h升高，而后下降趨于平穩(wěn)；模型組AST再灌注后6 ,24 h大幅度升高，極顯著高于假手術組(P<0.01)，而后下降趨于平穩(wěn)，較假手術組差異不顯著(表1)。

表1 不同時間點兩組血清中AST變化 IU/L

2.3 肝損傷大鼠全身氧化應激的變化

2.3.1血清中抗氧化酶SOD水平 假手術組SOD再灌注后6,24 h下降，而后升高趨于平穩(wěn)；模型組SOD再灌注后6,24 h大幅度降低，顯著低于假手術組(0.01

2.3.2血清中抗氧化酶GSH-Px水平 假手術組GSH-Px再灌注后6 h下降，而后升高趨于平穩(wěn)；模型組GSH-Px再灌注后6 h大幅度下降，極顯著低于假手術組(P<0.01)，而后升高趨于平穩(wěn)，再灌注后24 h顯著低于假手術組(0.01

表2 不同時間點兩組血清中SOD變化 U/L

表3 不同時間點兩組血清中GSH-Px變化 U/L

2.3.3血清中MDA水平 假手術組MDA再灌注后6 h升高，而后下降趨于平穩(wěn)；模型組MDA再灌注后6 h大幅度升高，極顯著高于假手術組(P<0.01)，而后下降趨于平穩(wěn)，再灌注后24 h顯著高于假手術組(0.01

表4 不同時間點兩組血清中MDA變化 μmol/L

2.4 肝損傷大鼠全身炎癥反應變化

2.4.1血清中促炎細胞因子TNF-α水平 假手術組TNF-α再灌注后24 h升高，而后下降趨于平穩(wěn)；模型組TNF-α再灌注后24 h大幅度升高，極顯著高于假手術組(P<0.01)，而后下降趨于平穩(wěn)，再灌注后72 h顯著高于假手術組(0.01

表5 不同時間點兩組血清中TNF-α的變化 ng/L

2.4.2血清中促炎細胞因子IL-1β水平 假手術組IL-1β再灌注后24 h升高，而后下降趨于平穩(wěn)；模型組IL-1β再灌注后24 h大幅度升高，顯著高于假手術組(0.01

表6 不同時間點兩組血清中IL-1β變化 ng/L

2.4.3血清中促炎細胞因子IL-6水平 假手術組IL-6再灌注后72 h下降，而后趨于平穩(wěn)；模型組IL-6再灌注后24 h大幅度升高，顯著高于假手術組(0.01

表7 不同時間點兩組血清中IL-6變化 ng/L

2.4.4血清中抗炎細胞因子IL-10水平 假手術組IL-10再灌注后72 h升高，而后下降趨于平穩(wěn)；模型組IL-10再灌注后72 h大幅度升高，極顯著高于假手術組(P<0.01)，而后下降趨于平穩(wěn)，再灌注后24 h 顯著高于假手術組(0.01

表8 不同時間點兩組血清中IL-10變化 ng/L

3 討論

肝IRI合并部分肝切除損傷引起的肝組織再生不足[6]和長時間缺血及再灌注造成嚴重的肝實質損傷，是造成臨床上發(fā)病和死亡的主要因素。近年來，不少外科醫(yī)生在動物肝切除模型中不斷改進保護肝免受IRI損傷的手術方法。隨著手術策略的改進，更加注重圍手術期的護理及患者體況的選擇，在肝切除術中研究了許多阻斷入肝血流的外科技術，包括Pringle法、間歇性Pringle法和半肝血管阻斷法等[7-9]。研究表明，Pringle法阻斷全肝血流后，由于內臟器官的缺血和充血以及血液動力學的改變，增加了對其他肝葉的損傷[7]。而其他研究發(fā)現(xiàn)，門靜脈阻斷保留肝動脈血流的缺血方法可降低大出血和術后肝功能衰竭的風險[8]。以往的研究比較門靜脈阻斷保留肝動脈血流和Pringle法缺血30 min再灌注后對78%肝切除后發(fā)現(xiàn)，前者的肝再生率較高[9]。YIN等[10]報道了肝血流阻斷30 min時會導致大鼠術后早期的DNA合成和肝細胞增殖減少，并抑制肝功能的恢復及輕微的可逆損害。在臨床上，經常會遇到脂肪肝、肝硬化等并發(fā)癥，比正常肝臟更敏感，進一步增加了術后預后不良的可能性，一旦切除，剩余肝臟不足以滿足全身的需求，因此本課題組對以往的手術模型進行改進，成功建立了大鼠70%肝IRI合并30%部分肝切除損傷模型，在缺血期間行部分缺血肝葉的切除，減少再灌注后的失血量，以模擬臨床上肝不規(guī)則切除術、肝移植等。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，IRI損傷是全身性的，可導致多個器官、組織功能損傷，其中氧化應激和炎癥反應起關鍵作用。本研究發(fā)現(xiàn)肝實質受損時釋放大量AST，同時檢測血清中氧化應激及炎癥因子的變化，發(fā)現(xiàn)模型組機體內氧化應激和促炎因子的水平較假手術組均明顯升高，證實大鼠70%肝IRI合并部分肝切除損傷可誘導機體氧化應激和炎癥反應的發(fā)生。

SOD是動物機體內關鍵的抗氧化酶之一，可將超氧陰離子自由基還原為過氧化氫，減少細胞內堆積的超氧陰離子自由基[11]。GSH在中和自由基、減少脂質過氧化物的產生和保持細胞完整性方面起著關鍵作用[12]，GSH和SOD在維持機體內氧化與抗氧化的平衡之間起著重要作用。MDA是機體內一系列脂質過氧化降解反應后的主要產物，其在機體內的濃度與機體清除自由基的能力呈正比，是反映肝組織受氧化應激損傷程度的間接客觀標志[13]。本研究結果顯示，模型組大鼠血清中SOD，GSH-Px酶水平在術后6，24，72，168 h各個時間點較假手術組均呈先下降后升高的趨勢，在術后24 h時達到最低值，且顯著低于假手術組。模型組大鼠血清中MDA水平在術后6，24，72，168 h各個時間點較假手術組均呈先升高后下降的趨勢，在術后6 h達到峰值，且顯著高于假手術組。GEDIK等[14]建立大鼠肝臟缺血45 min模型，血液供應恢復45 min后 SOD、CAT、GSH水平與正常對照組相比顯著降低，MDA水平與正常對照組相比顯著升高。葛延松等[15]利用腹腔鏡技術建立小型豬右半肝缺血60 min 后行左半肝的切除，檢測再灌注后1，3，7 d血清中SOD、GSH-Px和MDA水平，發(fā)現(xiàn)再灌注后SOD和GSH-Px隨再灌注時間的延長呈先降低后升高的趨勢，并在1 d時出現(xiàn)最低值；MDA水平隨再灌注時間的延長呈先升高后降低的趨勢，并在1 d時出現(xiàn)峰值。結合本研究結果，提示SOD、GSH和MDA在肝臟IRI合并部分肝切除損傷中維持機體氧化與抗氧化動態(tài)平衡中起著重要作用。

在IRI過程中，Kupffer細胞可能被激活，分泌大量細胞因子和趨化因子，細胞促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6在先天性免疫應答中起重要作用，而細胞抗炎因子IL-10具有負性免疫調節(jié)作用[16]。LIAO等[17]報道在大鼠70%肝臟缺血60 min 再灌注6 h后，促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6均較假手術組升高，抗炎因子IL-10較假手術組降低。孟偉靜等[18]研究發(fā)現(xiàn)，在小型豬右半肝缺血60 min 后行左半肝切除，檢測再灌注后2，6，1，2，3，5，7 d血清中TNF-α、IL-1β、IL-6較假手術組均顯著升高，在術后1 d達到峰值，IL-10在術后3 d達到峰值。

大鼠70%肝IRI合并部分肝切除損傷可誘導機體氧化應激和炎癥反應的發(fā)生，其機制可能與抗氧化酶水平的下調及促炎細胞因子表達增強有關。