5種中藥多糖通過Keap1-Nrf2通路緩解代森錳鋅氧化和卵巢毒性

張林超，宮英闌，溫 冉，包佳鷺，張 妍，王曉丹

(河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

代森錳鋅(mancozeb，MCZ)是一種乙烯-二硫代氨基甲酸錳和鋅鹽的混合物，自1948年以來一直在多種農(nóng)作物、觀賞植物和草坪上廣泛使用[1]。由于MCZ對(duì)廣譜真菌及其相關(guān)植物病害的有效性，其在全球范圍被廣泛應(yīng)用，且每年產(chǎn)量都有上升的趨勢(shì)。另外MCZ在工業(yè)上也有廣泛應(yīng)用，如應(yīng)用于糖業(yè)和造紙業(yè)；用作水冷卻系統(tǒng)中的除黏劑；橡膠工業(yè)中的硫化促進(jìn)劑和抗氧化劑；以及由于其螯合特性而在廢水處理中用作清除劑[2]。然而，這種化學(xué)物質(zhì)的大范圍應(yīng)用會(huì)通過一系列自然過程如地表徑流漂移和浸出導(dǎo)致環(huán)境污染，并且以可測(cè)量的濃度存在于大氣、土壤、地表水和地下水中對(duì)非目標(biāo)生物體帶來風(fēng)險(xiǎn)[3]。

PANGANIBAN等[4]發(fā)現(xiàn)，施用MCZ后可以在植物和環(huán)境(空氣、土壤、水)中檢測(cè)到MCZ的主要代謝產(chǎn)物乙烯硫脲(ETU)。MEDDA等[5]也發(fā)現(xiàn)在意大利應(yīng)用較多MCZ的葡萄園附近，人群中ETU水平較高，平均值幾乎達(dá)到12.2 μg/L。加拿大啟用的幾個(gè)農(nóng)藥檢測(cè)項(xiàng)目發(fā)現(xiàn)，1994—2002年，已有16起魚類死亡事件與MCZ徑流事件有關(guān)[6]。MCZ被認(rèn)為是一種潛在的雌激素干擾物和疑似致癌物[7]。研究表明，MCZ可以損傷女性的生殖系統(tǒng)[8]，影響健康卵泡的大小和數(shù)量[9]，使閉鎖卵泡增加[10]，影響母體的受精能力；還可以改變雌性發(fā)情周期以及影響胚胎著床[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，80%MCZ(Dithane-M45)暴露顯著升高雞胚的死亡率，損害雞胚下肢的正常發(fā)育[12]。另外，奶牛吃了殘留有MCZ的牧草后，MCZ會(huì)積聚在牛全身損傷機(jī)體健康，并透過血乳屏障存在于牛奶中[13]。據(jù)報(bào)道，每天暴露25 mg/kg的MCZ就會(huì)損傷狗的甲狀腺功能[14]。

由于MCZ對(duì)環(huán)境和動(dòng)物健康構(gòu)成威脅，人們對(duì)MCZ毒性的認(rèn)識(shí)正在逐步加強(qiáng)。據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激在MCZ毒理學(xué)中起重要作用[15]。CAT、SOD和GPX酶是構(gòu)成抗氧化防御系統(tǒng)的第一道屏障[16]。研究表明，Keap1-Nrf2通路具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老、抗細(xì)胞損傷、保護(hù)生育以及防止一些婦產(chǎn)科疾病的作用，它是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激水平的關(guān)鍵通路，該通路可調(diào)控多種靶基因的表達(dá)，包括Ⅱ相代謝酶基因和多種抗炎抗氧化基因，直接影響機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[17-18]。許多中藥成分都具有抗氧化活性，如山藥多糖(CYPS)、枸杞多糖(LBP)、黃芪多糖(APS)等[19]。已有大量研究發(fā)現(xiàn)，許多藥物可激活或抑制Nrf2信號(hào)通路，其中包括中藥及其有效成分，它們可減弱或防止氧化應(yīng)激對(duì)正常細(xì)胞造成的損傷[20]。如有研究發(fā)現(xiàn)，APS可通過調(diào)節(jié)Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路的表達(dá)，提高心肌的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激[21]。

目前，關(guān)于MCZ氧化毒性的研究大多集中在一般的器官毒性，MCZ對(duì)雌激素的分泌干擾狀況及機(jī)體的氧化損傷機(jī)制尚未得到深入研究，而且關(guān)于如何緩解MCZ毒性也鮮有報(bào)道。本研究分別從器官組織形態(tài)學(xué)水平、血液激素水平、組織激素受體及 Keap1-Nrf2調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄水平這3方面探討MCZ氧化損傷機(jī)理及中藥多糖對(duì)MCZ毒性的緩解作用。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器MCZ(商品級(jí)Dithane-M45，80%)；LBP(80%)、APS(90%)、CYPS(30%)、菟絲子多糖(CCP，30%)和甘草多糖(GP，30%)均購自西安圣青生物科技有限公司；Go Taq?PCR Master Mix(A6001 Promega，USA)；Go ScriptTMReverse Transcription System (A5001，Promega，USA)；Eastep?Super總RNA提取試劑盒(LS1040，Promega，北京)；MDA、CAT、SOD試劑盒(南京建成)； ERα和ERβ試劑盒(酶聯(lián)生物，上海)；引物(大連寶生物有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理選用6周齡未經(jīng)產(chǎn)的SPF級(jí)昆明小鼠，購自斯貝福(北京)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。小鼠每日給予光照、黑暗各12 h，室內(nèi)溫度控制在(25.0±0.5)℃，濕度50%～60%。自由采食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將小鼠隨機(jī)分為7組(A、B、C、D、E、F、G)，A組每天分2次灌服0.2 mL去離子水，B組分2次灌服100 mg/kg MCZ和0.2 mL去離子水，C、D、E、F和G組每天灌服100 mg/kg的MCZ及分別灌服200 mg/kg的LBP、APS、GP、CCP和CYPS。本研究中動(dòng)物的使用經(jīng)河北省動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)批準(zhǔn)，動(dòng)物處理過程通過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的動(dòng)物倫理學(xué)審查。

1.3 指標(biāo)測(cè)定

1.3.1小鼠臟器指數(shù)計(jì)算方法 稱取小鼠體質(zhì)量，處死后，剖開腹腔，取卵巢和子宮，除去多余脂肪后稱質(zhì)量。

卵巢指數(shù)=卵巢質(zhì)量(mg)÷體質(zhì)量(g)×100%

子宮指數(shù)=子宮質(zhì)量(mg)÷體質(zhì)量(g)×100%

1.3.2小鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察 取出小鼠卵巢后固定在配置好的4%多聚甲醛溶液中，常規(guī)制備5 μm 石蠟組織切片，經(jīng)蘇木精-伊紅(HE)在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.3小鼠血清中CAT、SOD、MDA檢測(cè) 小鼠眼球采血，血液經(jīng)3 500 r/min離心，取上清。上清液分別用過氧化氫酶(CAT)試劑盒檢測(cè)CAT活力、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒檢測(cè)SOD活力和丙二醛(MDA)試劑盒檢測(cè)MDA含量。

1.3.4小鼠血清中FSH、LH、E2含量檢測(cè) 用1.3.3中所得上清液根據(jù)北京萊博泰瑞科技發(fā)展有限公司放射免疫法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5小鼠卵巢中ERα和ERβ含量測(cè)定 將卵巢制備成10%組織勻漿，3 500 r/min離心后，吸取上清液，按照酶聯(lián)生物科技有限公司(上海，中國)ELISA試劑盒說明書操作測(cè)定上清液中小鼠卵巢ERα和ERβ水平。

1.3.6小鼠卵巢中Keap1-Nrf2通路下游基因mRNA表達(dá) 根據(jù)總RNA提取試劑盒提取肝臟中的總RNA，將得到的RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定，發(fā)現(xiàn)其D260/D280值都為1.9～2.1，表明RNA純度較高。然后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA用于后續(xù)研究。采用Real-time PCR法對(duì)目的基因進(jìn)行檢測(cè)，引物由大連寶生物有限公司設(shè)計(jì)合成。循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，40個(gè)PCR循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，用2-△△Ct表示各目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物長度

2 結(jié)果

2.1 中藥多糖對(duì)小鼠體質(zhì)量和臟器指數(shù)的影響由表2數(shù)據(jù)可知，與空白對(duì)照組相比，MCZ處理組小鼠體質(zhì)量極顯著降低(P<0.01)，卵巢指數(shù)極顯著上升(P<0.01)，子宮指數(shù)極顯著上升(P<0.01)。與模型組(MCZ)相比，中藥多糖處理組都能緩解MCZ毒性作用，但LBP處理組無顯著性差異；APS組卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)與MCZ組有極顯著差異(P<0.01)；CCP組體質(zhì)量和子宮指數(shù)與MCZ組差異顯著(P<0.05)；CYPS組與MCZ組體質(zhì)量和卵巢指數(shù)差異顯著(P<0.05)，子宮指數(shù)差異極顯著(P<0.01)；GP組與MCZ組體質(zhì)量差異顯著(P<0.05)，卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)差異極顯著(P<0.01)。綜上所述，中藥多糖能夠緩解MCZ對(duì)小鼠的損傷，其中GP緩解效果較好。

2.2 小鼠卵巢組織學(xué)觀察從圖1可以看出，空白組成年小鼠卵巢內(nèi)可以看到一定數(shù)量結(jié)構(gòu)完整、界限清晰、依次排列的成熟卵泡。MCZ處理組小鼠卵巢內(nèi)，卵泡數(shù)量減少、界限模糊、結(jié)構(gòu)遭到破壞。經(jīng)LBP、APS、GP、CCP和CYPS治療后，MCZ對(duì)卵巢的損傷有所恢復(fù)，如卵巢內(nèi)卵泡較MCZ組增多，APS、GP、CCP和CYPS治療后卵泡間有相對(duì)清晰的界限；但與空白組相比，卵泡界限不夠清晰、成熟卵泡數(shù)量較少。綜上，MCZ處理，能夠?qū)π∈舐殉苍斐蓳p傷，減少成熟卵泡數(shù)量，LBP、APS、GP、CCP和CYPS能夠緩解MCZ對(duì)卵巢的損傷作用。

表2 處理組小鼠體質(zhì)量、卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)

A.空白對(duì)照組；B.MCZ組；C.LBP組；D.APS組；E.GP組；F.CCP組；G.CPPS組

2.3 中藥多糖對(duì)血清中CAT、SOD、MDA的影響如圖2所示，與空白對(duì)照組相比，MCZ處理組CAT活力和MDA含量顯著降低(P<0.05)，SOD活力極顯著降低(P<0.01)。與MCZ組相比，LBP、APS和CCP處理組CAT活力極顯著升高(P<0.01)，GP組顯著升高(P<0.05)，且與空白組無顯著性差異。LBP和GP組SOD活力較MCZ組極顯著升高(P<0.01)，與空白組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。APS組與MCZ組相比SOD活力顯著升高(P<0.05)，但與空白組差異顯著(P<0.05)。GP組MDA含量比MCZ組極顯著升高(P<0.01)，與空白組無顯著性差異。LBP、APS、CCP和CYPS組與MCZ組MDA含量無顯著性差異；與空白組相比，APS和CCP組MDA含量差異極顯著(P<0.01)，CYPS組差異顯著(P<0.05)。因此，GP能夠較好得緩解MCZ對(duì)CAT、SOD和MDA的影響。

2.4 中藥多糖對(duì)血清中FSH、LH、E2含量的影響如圖3所示，與空白組相比，MCZ和CYPS組FSH含量顯著降低(P<0.05)，LBP和GP組極顯著降低(P<0.01)，APS和CCP組與空白組無顯著性差異；與MCZ組相比，APS組FSH含量極顯著升高(P<0.01)，其他中藥多糖組無顯著性差異。與空白組相比，MCZ和CCP組LH含量極顯著降低(P<0.01)，CYPS組顯著降低(P<0.05)；與MCZ組相比，LBP和APS組FSH含量極顯著升高(P<0.01)，GP和CYPS組顯著升高(P<0.05)。與空白組相比，MCZ和CYPS組E2含量顯著升高(P<0.05)，LBP和APS組極顯著升高(P<0.01)；與MCZ組相比，APS組極顯著升高(P<0.01)，CCP組極顯著降低(P<0.01)。

圖2 中藥多糖對(duì)血清中CAT、SOD、MDA的影響

圖3 中藥多糖對(duì)血清中FSH、LH、E2的影響

2.5 中藥多糖對(duì)卵巢中ERα和ERβ含量的影響從圖4可以看出，與空白組相比，MCZ能夠極顯著降低ERα含量(P<0.01)，并顯著降低ERβ含量(P<0.05)。與MCZ組相比，LBP、CCP和CYPS組ERα含量極顯著升高(P<0.01)，GP組ERα含量顯著升高(P<0.05)，APS組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；與空白組相比，CCP組ERα含量極顯著(P<0.01)升高，LBP組顯著(P<0.05)升高，其他組無顯著性差異。與MCZ組相比，LBP和GP組ERβ含量顯著(P<0.05)升高，CCP和CYPS組ERβ含量極顯著(P<0.01)升高，APS組無顯著性差異；且與空白組都無顯著性差異。綜上所述，GP和CYPS緩解可MCZ對(duì)卵巢中ERα和ERβ含量的影響。

圖4 中藥多糖對(duì)卵巢中ERα和ERβ的影響

2.6 中藥多糖對(duì)卵巢中Keap1-Nrf2通路下游基因mRNA表達(dá)的影響由圖5可知，與空白組相比，MCZ處理組顯著降低HO-1、NQO1、Gstt2和GcLc mRNA的表達(dá)量(P<0.05)，顯著升高Gpx2 mRNA的表達(dá)量(P<0.05)。與MCZ組比較，LBP處理極顯著升高HO-1 mRNA的表達(dá)量(P<0.01)，GP處理顯著升高HO-1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)；LBP極顯著降低Gpx2 mRNA的表達(dá)量(P<0.01)，APS和GP顯著降低Gpx2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)；LBP、APS和GP顯著升高NQO1 mRNA的表達(dá)(P<0.05)；GP極顯著升高Gstt2 mRNA的表達(dá)(P<0.01)，CYPS顯著升高Gstt2 mRNA的表達(dá)(P<0.05)；GP顯著升高GcLc mRNA的表達(dá)(P<0.05)。綜上所述，GP可以較好地逆轉(zhuǎn)MCZ對(duì)卵巢中Keap1-Nrf2通路下游基因mRNA表達(dá)的影響。

圖5 中藥多糖對(duì)卵巢中Keap1-Nrf2通路下游基因mRNA表達(dá)影響

3 討論

大量文獻(xiàn)研究表明，MCZ在全球范圍內(nèi)的廣泛應(yīng)用導(dǎo)致成年動(dòng)物每天暴露在500～1 500 mg/kg MCZ的時(shí)間較長[22]。而關(guān)于MCZ毒性的研究表明，當(dāng)小鼠暴露在100 mg/kg MCZ時(shí)能夠引起小鼠損傷。因此本試驗(yàn)通過口服灌胃的方法建立MCZ暴露損傷模型，探究能夠緩解MCZ毒性的中藥多糖。

WHO已經(jīng)將MCZ歸類為二級(jí)或劇毒化學(xué)物質(zhì)，幾項(xiàng)研究都表明，暴露MCZ及其主要代謝物ETU與各種健康問題有關(guān)，包括癌癥、內(nèi)分泌失調(diào)和生殖障礙等[23-24]。BALIGAR等[25]研究發(fā)現(xiàn)，MCZ處理組較空白組大鼠體質(zhì)量減輕，本試驗(yàn)證明MCZ可以降低小鼠體質(zhì)量，而GP、CCP和CYPS治療逆轉(zhuǎn)了MCZ對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響。本研究還發(fā)現(xiàn)MCZ處理增加了小鼠卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)，其中APS、CYPS和GP治療可以有效降低卵巢指數(shù)和子宮指數(shù)，卵巢組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，暴露MCZ的小鼠健康卵泡數(shù)目減少。有研究表明，暴露MCZ導(dǎo)致大鼠閉鎖卵泡數(shù)量增加，健康卵泡數(shù)減少，黃體數(shù)量減少[26],與本研究結(jié)果一致。說明MCZ可能通過損傷卵巢和子宮引起生殖障礙，而中藥多糖可以逆轉(zhuǎn)MCZ的這種影響。FSH、LH和E2的正常水平是影響卵巢正常發(fā)育和排卵的重要因素[27]。本研究用放射免疫法檢測(cè)血清中FSH、LH和E2的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCZ處理降低FSH和LH的含量，提高E2含量，MCZ可能通過引起內(nèi)分泌紊亂影響下丘腦-垂體-性腺軸[26]。但中藥多糖緩解MCZ對(duì)下丘腦-垂體-性腺軸損傷的效果并不理想。ERα和ERβ是維持卵巢顆粒細(xì)胞分化、卵泡和卵母細(xì)胞生長發(fā)育和排卵功能的關(guān)鍵受體[28-29]。本研究檢測(cè)卵巢中ERα和ERβ發(fā)現(xiàn)，MCZ降低ERα和ERβ在卵巢中的表達(dá)，而LBP、GP、CCP和CYPS逆轉(zhuǎn)了MCZ的這種影響。綜上，MCZ能夠引起生殖損傷，而中藥多糖可以緩解MCZ的損傷作用。

有研究認(rèn)為，MCZ作為氧化應(yīng)激源，通過誘導(dǎo)自由基的形成引起機(jī)體氧化應(yīng)激[30]。CAT、SOD和GPX酶是構(gòu)成抗氧化防御系統(tǒng)的第一道屏障[31]。本研究檢測(cè)小鼠血清中CAT和SOD活力以及MDA含量，發(fā)現(xiàn)MCZ能夠降低CAT和SOD活力和MDA含量。GIRISH等[32]發(fā)現(xiàn)MCZ誘導(dǎo)大鼠SOD、CAT活性降低。KAYHAN等[33]研究證實(shí)MCZ誘導(dǎo)斑馬魚心臟組織中MDA含量和CAT活性降低。這說明MCZ能夠作為氧化應(yīng)激原引起氧化應(yīng)激。大量研究發(fā)現(xiàn)，LBP[34]、APS[35]、GP[36]、CCP和CYPS[37]具有抗氧化作用。本研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，以上幾種多糖可以逆轉(zhuǎn)MCZ降低的CAT和SOD活力及MDA含量來對(duì)抗氧化應(yīng)激，其中GP較其他幾種多糖治療效果最好。

當(dāng)機(jī)體暴露于外源性毒物和氧化劑(例如重金屬、異種生物、自由基和藥物)會(huì)引起氧化應(yīng)激，其特征在于活性氧(ROS)水平高于正常生理水平狀態(tài)[38]。當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)氧化還原失衡時(shí)，Nrf2與Keap1分離，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，并與小的Maf蛋白結(jié)合，并與位于細(xì)胞保護(hù)性基因啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件(ARE)結(jié)合以激活其轉(zhuǎn)錄[39]。Nrf2調(diào)控的基因包括細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡蛋白(如:γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，γ-GCS)和Ⅱ期解毒酶[(如:NAD(P)H：醌氧化還原酶1(NQO1)]，能夠維持細(xì)胞的氧化還原能力并促進(jìn)有毒物質(zhì)的排泄[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，MCZ下調(diào)Keap1-Nrf2通路下游基因HO-1、NQO1、GcLc和Gstt2表達(dá)，上調(diào)Gpx2表達(dá)。而較MCZ組，LBP上調(diào)HO-1、NQO1、GcLc和Gstt2表達(dá)。QI 等[41]發(fā)現(xiàn)，LBP可以干預(yù)Keap1-Nrf2通路，上調(diào)HO-1、NQO1 mRNA表達(dá)。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)GP能夠較好地逆轉(zhuǎn)MCZ對(duì)Keap1-Nrf2通路下游基因表達(dá)的影響。說明MCZ通過Keap1-Nrf2通路對(duì)小鼠造成損傷，而GP可以干預(yù)Keap1-Nrf2通路緩解MCZ對(duì)小鼠的損傷作用。

暴露MCZ可引起小鼠氧化應(yīng)激，降低CAT和SOD活力及MDA含量，損傷小鼠卵巢，干預(yù)Keap1-Nrf2通路下游基因的表達(dá)，還可以擾亂雌激素和雌激素受體的表達(dá)，而LBP、APS、CCP、CYPS和GP可在一定程度上緩解MCZ對(duì)小鼠的毒性，其中GP的效果最好。