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    抗蓖麻毒素精制免疫球蛋白的制備及免疫防治效果評(píng)價(jià)

    2021-09-10 05:45:54楊曉嵐谷宏婧李欣昱段躍強(qiáng)范鐵炯楊鵬輝劉國(guó)鳳趙忠鵬
    關(guān)鍵詞:蓖麻中和精制

    楊曉嵐,李 敏,谷宏婧,李欣昱,段躍強(qiáng),范鐵炯,李 鑫,楊鵬輝,劉國(guó)鳳,劉 媛,閆 芳,賀 威,趙忠鵬*

    (1.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所 感染免疫與防治研究室,北京 100071;2.上海賽倫生物技術(shù)有限公司,上海201418;3.解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心,北京 100039;4.青島市婦女兒童醫(yī)院,山東 青島 266034;5.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,山西 太谷 030800;6.安徽醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,安徽 合肥 230032)

    蓖麻毒素是最為重要的毒素類生物戰(zhàn)劑,易獲得、易提取、易使用、難監(jiān)管,已列入1972年的生物武器公約及1997年的化學(xué)武器公約中[1]。自美國(guó)“911”恐怖襲擊和炭疽襲擊事件以來(lái),特別是蓖麻毒素驚現(xiàn)倫敦后,蓖麻毒素正式被美歐列為最有可能被用作恐怖襲擊的生物戰(zhàn)劑,引起了世界各國(guó)的高度重視[2]。早在2002年,美國(guó)政府就提出:“蓖麻毒素防治藥物是生物毒素戰(zhàn)劑醫(yī)學(xué)防護(hù)的重要研究方向”,每年都投入大量資金資助蓖麻毒素醫(yī)學(xué)防護(hù)領(lǐng)域的研究,重點(diǎn)集中在中毒治療性藥物和預(yù)防性疫苗,已取得了一定進(jìn)展[3]。而我國(guó)在救治藥物、預(yù)防疫苗研究方面還存有大量空白,研制安全、有效的防治藥物勢(shì)在必行[4]。

    鑒于人類與中毒病斗爭(zhēng)的經(jīng)驗(yàn),最有效、最經(jīng)濟(jì)的手段是抗血清的免疫防治。雖然抗體研究和使用歷經(jīng)百年,多次迭代,但是現(xiàn)今市場(chǎng)上仍流通著不同時(shí)代的產(chǎn)品,他們相互補(bǔ)充,無(wú)法完全取代[5]。尤其是馬抗血清制品的安全性、有效性、穩(wěn)定性在多個(gè)產(chǎn)品上已獲證實(shí),針對(duì)不同的抗血清產(chǎn)品僅是更換了相應(yīng)的免疫抗原,對(duì)制品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及安全性并無(wú)影響,是最便捷、最經(jīng)濟(jì)的抗體研發(fā)技術(shù)平臺(tái),應(yīng)得到充分利用[6]。

    1 材料與方法

    1.1 蓖麻毒素純品的制備及檢定稱取500 g去殼蓖麻籽,在5 mmol/L磷酸緩沖液中勻漿,用4層紗布濾去殘?jiān)?,?℃ 20 000×g離心30 min,取上清,加入固體(NH4)2SO4達(dá)到60%飽和度,置4℃ 3 h;20 000×g離心30 min,把沉淀溶解在適量緩沖液中,4℃透析24 h;4℃ 20 000×g離心10 min,上清液即為粗品。用4-氨苯基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷衍生化的瓊脂糖作為親和介質(zhì),用半乳糖洗脫以除去粗品中的雜蛋白;根據(jù)蓖麻毒素與凝集素對(duì)離子交換樹(shù)脂的結(jié)合能力不同,將凝集素與蓖麻毒素分離,最終得到純品。將純品進(jìn)行SDS-PAGE和HPLC純度檢定,并用小鼠測(cè)定半數(shù)致死量(LD50)值。

    1.2 蓖麻毒素脫毒將蓖麻毒素純品按甲醛1∶1 000 ~1∶8 000進(jìn)行脫毒,室溫條件下分別放置48,72,96,120,144 h,進(jìn)行透析袋濃縮、生理鹽水平衡、0.22 μm濾膜除菌試驗(yàn),Lowry法測(cè)蛋白含量并適量稀釋后,接種小鼠,每只接種0.5 mL,觀察1周,通過(guò)BALB/c小鼠存活情況,觀察脫毒效果。

    1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞體質(zhì)健康蒙古馬,4~6歲,10匹,經(jīng)檢疫符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》要求。SPF級(jí)BALB/c小鼠,6~8 周齡,購(gòu)自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司;Vero細(xì)胞,由軍事醫(yī)學(xué)研究院微生物流行病研究所細(xì)胞庫(kù)提供。

    1.4 馬抗蓖麻毒素原料血漿的制備將純化脫毒蓖麻毒素抗原(1∶1)與等體積的弗氏不完全佐劑混合,乳化,經(jīng)馬匹頜下、腹股溝淋巴結(jié)多點(diǎn)注射免疫,前4次基礎(chǔ)免疫劑量分別為4,4,5,6 mg,每次間隔21 d,末次免疫后14 d, MTT法測(cè)定血清效價(jià)不低于1∶64 000時(shí),采血,分離血清。

    1.6 MTT法測(cè)定蓖麻毒素精制免疫球蛋白對(duì)蓖麻毒素的中和效果將Vero細(xì)胞接種于96孔板,每孔100 μL,含細(xì)胞2×104個(gè)/孔,37℃培養(yǎng)24 h,細(xì)胞長(zhǎng)成單層。用DMEM培養(yǎng)基對(duì)蓖麻毒素精制免疫球蛋白(中和抗體活性10 000 U/mL)倍比稀釋,起始稀釋度為1∶4 000,共8梯度,而后用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液稀釋蓖麻毒素(起始質(zhì)量濃度0.75 g/L),再加入等量的蓖麻毒素液(含100 TCID50),37℃共孵育1 h,然后200 μL/孔依次加入預(yù)先吸出上清液的細(xì)胞孔,每個(gè)稀釋度設(shè)4個(gè)復(fù)孔,并設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照(不加毒素不加蓖麻毒素精制免疫球蛋白)、蓖麻毒素對(duì)照(加毒素不加蓖麻毒素精制免疫球蛋白)、正常馬免疫球蛋白對(duì)照(加毒素加正常馬免疫球蛋白)。每天觀察,當(dāng)蓖麻毒素對(duì)照孔細(xì)胞病變時(shí),加MTT(0.5 g/L)200 μL/孔染色4 h,吸去液體加終止液(10%SDS+0.01 mol/L HCl)200 μL/孔溶解8 h,測(cè)定D570值。

    1.7 動(dòng)物法測(cè)定蓖麻毒素精制免疫球蛋白對(duì)蓖麻毒素的中和效果選用BALB/c小鼠30只,分6組,5只/組。用0.01 mol/L PBS對(duì)蓖麻毒素稀釋5個(gè)梯度,分別為10,50,100,500,1 000 LD50,每個(gè)梯度的終體積為0.2 mL;用0.01 mol/L PBS將蓖麻毒素精制免疫球蛋白稀釋4倍,按終體積0.2 mL/梯度,分別加入不同稀釋度的蓖麻毒素,37℃溫箱孵育1 h,同時(shí)設(shè)正常馬免疫球蛋白對(duì)照組。將中和后的混合液腹腔注射BALB/c小鼠0.4 mL/只,每天觀察小鼠死亡情況,連續(xù)觀察72 h并記錄結(jié)果。以在BALB/c小鼠體內(nèi)中和1 LD50蓖麻毒素所需用精制免疫球蛋白的量為1個(gè)用藥單位(U),標(biāo)示精制免疫球蛋白含量。

    1.8 蓖麻毒素精制免疫球蛋白制品在動(dòng)物體內(nèi)有效性研究

    1.8.1測(cè)定蓖麻毒素對(duì)小鼠的LD50小鼠30只,5只/組,共6組。腹腔注射蓖麻毒素量分別為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12 μg,每只注射劑量為0.2 mL。每天觀察并記錄小鼠存活數(shù),根據(jù)Reed-Munch公式計(jì)算LD50值。

    1.8.2小鼠體內(nèi)預(yù)防試驗(yàn) 選用小鼠25只,分5組,5只/組,稱體質(zhì)量。用0.01 mol/L PBS 1∶400稀釋制品,每只小鼠靜脈注射0.2 mL,對(duì)照組每只小鼠注射同等量的0.01 mol/L PBS 0.2 mL。分別于注射免疫球蛋白后3,4,5,6 d腹腔注射0.01 mol/L PBS稀釋的蓖麻毒素5 LD50,每天稱小鼠體質(zhì)量,并記錄死亡情況。

    1.8.3小鼠體內(nèi)治療試驗(yàn) 選用小鼠25只,分5組,5只/組,稱體質(zhì)量。用0.01 mol/L PBS稀釋蓖麻毒素,每只小鼠腹腔注射5 LD50/0.2 mL建立感染動(dòng)物模型。分別于注射蓖麻毒素后2,3,4,5 h靜脈注射0.01 mol/L PBS 稀釋的免疫球蛋白25 U/0.2 mL,每天稱小鼠體質(zhì)量,并記錄死亡情況。

    1.9 安全性檢測(cè)按照現(xiàn)行《中國(guó)藥典》要求,對(duì)制品進(jìn)行無(wú)菌試驗(yàn)、熱原檢查、異常毒性試驗(yàn)、一般藥理試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、免疫毒性試驗(yàn)、溶血和血管刺激性試驗(yàn)。

    2 結(jié)果

    2.1 蓖麻毒素純品的制備及檢定對(duì)制備的蓖麻毒素純品進(jìn)行檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示,經(jīng)初步優(yōu)化后,純化的蓖麻毒素純度均在90%以上,腹腔注射對(duì)小鼠LD50值約為6.38 μg/kg(圖1)。

    A.蓖麻毒素 SDS-PAGE代表性結(jié)果(M.蛋白Marker;1.親和層析洗脫液;2.離子交換層析穿過(guò)液;3.洗脫液);B.蓖麻毒素 HPLC檢測(cè)

    2.2 蓖麻毒素純品的脫毒及驗(yàn)證經(jīng)常規(guī)毒素脫毒試驗(yàn)驗(yàn)證(表1),甲醛濃度為1∶4 000,室溫脫毒96 h,蓖麻毒素被完全脫毒。

    表1 不同甲醛濃度脫毒蓖麻毒素純品效果

    A.蓖麻毒素精制免疫球蛋白SDS-PAGE結(jié)果(M.蛋白Marker;1.血漿;2.S/D滅活血漿;3.蓖麻毒素精制免疫球蛋白);B.蓖麻毒素精制免疫球蛋白HPLC結(jié)果

    2.4 MTT法測(cè)定蓖麻毒素精制免疫球蛋白效價(jià)MTT法測(cè)得正常馬血清免疫球蛋白對(duì)蓖麻毒素沒(méi)有中和效果,蓖麻毒素精制免疫球蛋白對(duì)蓖麻毒素的抗體效價(jià)為1∶128 000,說(shuō)明研制的蓖麻毒素精制免疫球蛋白具有很好的中和抗體活性(表2)。

    表2 MTT法測(cè)定蓖麻毒素精制免疫球蛋白對(duì)蓖麻毒素中和效果 D570值

    2.5 動(dòng)物法測(cè)定蓖麻毒素精制免疫球蛋白對(duì)蓖麻毒素的中和抗體效價(jià)動(dòng)物法測(cè)定蓖麻毒素精制免疫球蛋白可完全中和500 LD50蓖麻毒素,小鼠健康存活,而正常馬免疫球蛋白對(duì)照組小鼠48 h內(nèi)全部死亡,中和抗體效價(jià)超過(guò)6 000 U/mL(表3)。

    表3 蓖麻毒素精制免疫球蛋白在小鼠體內(nèi)的中和抗體效價(jià)(存活數(shù)比例,n=5)

    2.6 蓖麻毒素精制免疫球蛋白在小鼠體內(nèi)的防治效果當(dāng)小鼠腹腔注射用量為1 250 U/kg蓖麻毒素精制免疫球蛋白時(shí),分別于3,4,5 d注射5 LD50蓖麻毒素后,給藥小鼠均未見(jiàn)死亡,并且7 d 后體質(zhì)量均可恢復(fù)至給藥前水平;而給藥后6 d 注射蓖麻毒素的小鼠,于注射毒素72 h內(nèi)全部死亡;對(duì)照組在注射蓖麻毒素后48 h內(nèi)全部死亡(表4)。

    表4 蓖麻毒素精制免疫球蛋白在小鼠體內(nèi)的預(yù)防效果(n=5)

    當(dāng)腹腔注射5 LD50蓖麻毒素感染小鼠發(fā)病后,分別在2,3,4 h靜脈注射蓖麻毒素精制免疫球蛋白,發(fā)病的小鼠全部存活,給藥后體質(zhì)量雖有下降,但7 d小鼠體質(zhì)量均恢復(fù)至注射毒素前水平;當(dāng)5 h 后給予蓖麻毒素精制免疫球蛋白小鼠于144 h 內(nèi)全部死亡,而沒(méi)有給予蓖麻毒素精制免疫球蛋白的對(duì)照組小鼠48 h內(nèi)也全部死亡(表5)。

    表5 蓖麻毒素精制免疫球蛋白在小鼠體內(nèi)的治療效果(n=5)

    2.7 蓖麻毒素精制免疫球蛋白的安全性按照現(xiàn)行《中國(guó)藥典》要求,委托北京昭衍新藥研究中心,開(kāi)展無(wú)菌試驗(yàn)、熱原檢查、異常毒性試驗(yàn)、一般藥理試驗(yàn)、急性毒性試驗(yàn)、免疫毒性試驗(yàn)、溶血和血管刺激性試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果均符合現(xiàn)行《中國(guó)藥典》要求,具有良好的安全性。

    3 討論

    蓖麻毒素作為最有可能被用作恐怖襲擊的生物戰(zhàn)劑,防治藥物研究是醫(yī)學(xué)防護(hù)的重中之重。蓖麻毒素預(yù)防性疫苗在美國(guó)已經(jīng)完成Ⅰ期臨床試驗(yàn),具有一定的安全性和有效性,在我國(guó)還未見(jiàn)報(bào)道[8];蓖麻毒素中和性單抗國(guó)內(nèi)外均有報(bào)道,可在緊急條件下有條件批準(zhǔn)使用,其難于生產(chǎn)、價(jià)格貴,限制了其臨床應(yīng)用[9]。

    抗體研發(fā)最核心的環(huán)節(jié)之一是免疫原的制備。由于功能性蓖麻毒素的工程性表達(dá)難度大、成本高[10],故本研究選擇從蓖麻籽中提取,原料充足、成本低廉,在借鑒其他團(tuán)隊(duì)成功提取蓖麻毒素粗品經(jīng)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,根據(jù)蓖麻毒素的性質(zhì),增加了親和層析和離子交換層析方法,獲得了純度90%以上的純品,為免疫動(dòng)物用抗原提供了物質(zhì)基礎(chǔ),也為動(dòng)物模型建立提供了高品質(zhì)的毒素。蓖麻毒素脫毒是制備免疫用抗原較為重要的環(huán)節(jié),脫毒不足,會(huì)造成馬匹的死亡;脫毒過(guò)量,會(huì)造成免疫馬匹中和效價(jià)降低,導(dǎo)致最終制品雜質(zhì)多、品質(zhì)差,在不斷摸索中,課題組找到了最佳的滅活條件。

    抗體研發(fā)最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一是治療性抗體的評(píng)價(jià)。本研究建立了蓖麻毒素中毒細(xì)胞模型和動(dòng)物模型。在2個(gè)模型中,均證明制品的有效性,為臨床試驗(yàn)奠定了藥理學(xué)基礎(chǔ),也為藥效學(xué)評(píng)價(jià)中細(xì)胞替代動(dòng)物研究奠定基礎(chǔ)。遵從動(dòng)物倫理學(xué)的要求,在制品批簽發(fā)時(shí),盡量用細(xì)胞模型測(cè)定制品的抗體效價(jià),以減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用量[11]。

    總之,利用現(xiàn)代生物制藥技術(shù),本試驗(yàn)成功制備蓖麻毒素精制免疫球蛋白,有望成為蓖麻毒素中毒的“救命藥”,正在加緊進(jìn)行臨床研究,以爭(zhēng)取早日上市,為中毒患者服務(wù)。

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