重組溶瘤腺病毒對(duì)肺癌干細(xì)胞的抑制作用

李文杰，蘭 添，王茂鵬，李一權(quán)，尚 超，肖朋朋*，孫文超*，金寧一 *， 李 霄*

(1.溫州大學(xué) 病毒學(xué)研究所，浙江 溫州 325000；2.長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué) 吉林省院士工作站，吉林 長(zhǎng)春 130122)

癌癥是人類死亡的主要病因之一。2020年，全球大約有1 930萬例新發(fā)癌癥病例和近1 000萬癌癥死亡病例,其中肺癌新發(fā)病例大約220萬，發(fā)病率僅次于乳腺癌居第二位，并且肺癌的死亡率在癌癥中排名第一，大約每年有 180 萬人因肺癌死亡(18%)[1]。在癌癥內(nèi)部有一部分細(xì)胞被稱為癌癥干細(xì)胞，這部分細(xì)胞在癌癥起始、治療抵抗、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)中起關(guān)鍵作用[2]。這意味著，以肺癌干細(xì)胞為靶標(biāo)可能是根除肺癌的有效治療策略。靶向殺傷癌癥干細(xì)胞可能有助于開發(fā)針對(duì)癌癥的新型治療策略，在治療癌癥時(shí)可能具有臨床優(yōu)勢(shì)。

本課題組前期構(gòu)建了對(duì)腫瘤細(xì)胞具有特異性殺傷作用的重組溶瘤腺病毒Ad-Apoptin-hTERTp-E1a(Ad-VT)[3]，Ad-VT使用腫瘤特異性啟動(dòng)子 hTERTp來誘導(dǎo)其在腫瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制，同時(shí)含有 VP3 基因，表達(dá)具有腫瘤特異性殺傷作用的 Apoptin 蛋白，能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞中的特異性復(fù)制及對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異性殺傷作用。Ad-Mock 為不含 hTERTp和 Apoptin 基因的腺病毒載體。本研究擬利用課題組前期構(gòu)建的Ad-VT作用于肺癌干細(xì)胞，分析重組溶瘤腺病毒對(duì)肺癌干細(xì)胞的殺傷作用，探討Ad-VT對(duì)肺癌干細(xì)胞的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料重組溶瘤腺病毒由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存；人肺癌干細(xì)胞A549-CSC由本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)磁珠分選所得并保存；CCK-8購自日本同仁；JC-1購自美國 Life 公司； Transwell Permeable Support購自美國 Corning公司；BIOCOAT Matrigel 侵襲小室、Annexin Ⅴ-FITC/PI 試劑盒購自美國 BD 公司。

1.2 CCK-8法檢測(cè)重組溶瘤腺病毒Ad-VT對(duì)肺癌干細(xì)胞存活率的影響制備肺癌干細(xì)胞A549-CSC 細(xì)胞96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，將制備好的96孔板置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12～24 h。根據(jù) Ad-VT、Ad-Mock 的毒價(jià)計(jì)算出每孔細(xì)胞 100 MOI 的劑量所需的病毒體積。將96孔板取出，分別感染 100 MOI 的重組腺病毒 Ad-VT、Ad-Mock。另外設(shè)置未感染病毒的細(xì)胞對(duì)照組以及無細(xì)胞空白組。將感染病毒后的A549-CSC細(xì)胞96孔板繼續(xù)培養(yǎng) 24～72 h，分別在感染重組腺病毒后24，48，72 h 各取出1個(gè)96孔板，避光條件下加入CCK-8，置于 37℃避光孵育4 h后將96孔板放入酶標(biāo)儀中測(cè)定 450 nm 處的D值,計(jì)算各組細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=[(D試驗(yàn)孔-D空白孔)/(D對(duì)照孔-D空白孔)]×100%。

1.3 Annexin Ⅴ-FITC/PI染色檢測(cè)Ad-VT誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞凋亡的作用制備肺癌干細(xì)胞A549-CSC 細(xì)胞6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，將制備好的6孔板置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12～24 h。將6孔板取出，分別感染 100 MOI 的重組腺病毒 Ad-VT、Ad-Mock,另外設(shè)置未感染病毒的 Control 組。將感染病毒后的A549-CSC細(xì)胞6孔板繼續(xù)培養(yǎng) 24～72 h，分別在感染重組腺病毒后 24，48，72 h 各取出1個(gè)6孔板，收集各孔中的細(xì)胞，消化為單細(xì)胞后，3 000 r/min 離心 5 min，棄掉上清液，使用 500 μL 的 l×Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，避光條件下，每個(gè)樣品中加入 5 μL 的 AnnexinⅤ-FITC 和 5 μL 的 PI 混勻，避光室溫染色 15 min。染色結(jié)束后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.4 JC-1染色檢測(cè)Ad-VT對(duì)肺癌干細(xì)胞線粒體膜電位的影響按照1.3中方法制備A549-CSC細(xì)胞6孔板并感染腺病毒，培養(yǎng)24～72 h，分別在感染重組腺病毒后24,48,72 h 各取出1個(gè)6孔板，收集各孔中的細(xì)胞，消化為單細(xì)胞后，3 000 r/min 離心 5 min,棄掉上清液，加入1 mL雙無F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，避光加入1 μL濃度5 mmol/L的JC-1染液，混合均勻，此時(shí)JC-1工作濃度為5 μmol/L，37℃避光孵育30 min。孵育結(jié)束后，3 000 r/min 離心 5 min，棄掉上清,雙無F12清洗一次。離心去除上清后，使用500 μL的雙無 F12培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞，分別使用熒光顯微鏡及流式細(xì)胞儀進(jìn)行線粒體膜電位檢測(cè)。

1.5 Transwell 遷移試驗(yàn)檢測(cè)Ad-VT對(duì)肺癌干細(xì)胞的遷移抑制使用肺癌干細(xì)胞A549-CSC 制備24孔板，每孔5×104個(gè)細(xì)胞，將制備好的24孔板置于 37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12～24 h。將 24 孔板取出，分別感染100 MOI 的重組腺病毒 Ad-VT、Ad-Mock。另外設(shè)置未感染病毒的 Control 組。將感染病毒后的 A549-CSC細(xì)胞 24 孔板繼續(xù)培養(yǎng)24～72 h，分別在感染重組腺病毒后 24,48,72 h 各取出1個(gè)24孔板，收集孔中的細(xì)胞，消化為單細(xì)胞后離心，取一塊新的 24 孔板，每孔加入 500 μL 10% F12，此為下室。放入 Transwell 小室，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 Transwell小室中，200 μL/孔，此為上室。將 24 孔板繼續(xù)培養(yǎng) 24 h后取出，棄去上室中的液體，使用無菌棉簽輕柔地將上層未穿膜的細(xì)胞全部拭去，避光在下室中加入 60 μL 的 CCK-8，置于 37℃避光孵育4 h，放入酶標(biāo)儀中測(cè)定 450 nm 處的D值。之后取出 24 孔板，對(duì)小室進(jìn)行結(jié)晶紫染色。將 Transwell 小室放入4%多聚甲醛溶液，室溫固定細(xì)胞10 min。使用 ddH2O 進(jìn)行清洗后，將 Transwell 小室放入結(jié)晶紫溶液中，室溫下染色 10 min。結(jié)晶紫染色結(jié)束后，使用 ddH2O 進(jìn)行清洗，將 Transwell 小室倒置放于室溫下晾干，然后于顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.6 Biocoat 侵襲試驗(yàn)檢測(cè)Ad-VT對(duì)肺癌干細(xì)胞的侵襲抑制按照1.5方法制備A549-CSC細(xì)胞24孔板并感染腺病毒，培養(yǎng)24～72 h，分別在感染重組腺病毒后 24,48,72 h 各取出1個(gè)24孔板，收集孔中的細(xì)胞，消化為單細(xì)胞后離心，取一塊新的 24 孔板，每孔加入 500 μL 的10% F12，此為下室。放入Biocoat Matrigel 侵襲小室，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 BIOCOAT Matrigel侵襲小室中，此為上室。將制備好的 24孔板繼續(xù)培養(yǎng)24 h，按照1.5的試驗(yàn)方法進(jìn)行穿膜細(xì)胞的 CCK-8 檢測(cè)及結(jié)晶紫染色。將BIOCOAT Matrigel 侵襲小室倒置放于室溫下晾干，然后于顯微鏡下拍照，統(tǒng)計(jì)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)處理使用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0，數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，結(jié)果分析采用t檢驗(yàn)。P<0.05具有顯著性差異，P<0.01具有極顯著差異(*P<0.05，**P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 重組溶瘤腺病毒Ad-VT能夠降低肺癌干細(xì)胞A549-CSC的存活率結(jié)果見圖1。Ad-VT作用于A549-CSC后24～72 h，細(xì)胞存活率均顯著低于Control組(P<0.01)，而Ad-Mock作用后細(xì)胞的存活率與Control組無顯著性差異。Ad-VT作用于A549-CSC后，細(xì)胞存活率隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低，說明Ad-VT對(duì)A549-CSC細(xì)胞的作用具有時(shí)間效應(yīng)。

圖1 重組腺病毒對(duì)細(xì)胞存活率的影響(**P<0.01)

2.2 Ad-VT誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞A549-CSC凋亡用Annexin Ⅴ-FITC/PI對(duì)凋亡的肺癌干細(xì)胞染色后，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，檢測(cè)結(jié)果見圖2。Ad-Mock作用后，A549-CSC細(xì)胞未發(fā)生明顯凋亡，細(xì)胞凋亡率與Control組相比無顯著性差異；Ad-VT作用于A549-CSC細(xì)胞后，與Control組相比，細(xì)胞發(fā)生了不同程度的凋亡(P<0.01)，且細(xì)胞凋亡率隨Ad-VT作用時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增加；說明重組溶瘤腺病毒Ad-VT能夠誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞發(fā)生凋亡。

2.3 Ad-VT降低肺癌干細(xì)胞線粒體膜電位用JC-1對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色后，JC-1能夠根據(jù)細(xì)胞線粒體狀態(tài)不同以不同的形式存在從而發(fā)射不同顏色的熒光，結(jié)果見圖3。使用熒光顯微鏡觀察JC-1染色的細(xì)胞，Ad-Mock與Control組細(xì)胞線粒體狀態(tài)良好，細(xì)胞中的JC-1以多聚體形式存在發(fā)出紅色熒光；而Ad-VT感染后的細(xì)胞紅色熒光減少，綠色熒光增加，說明細(xì)胞線粒體膜電位降低，細(xì)胞中的JC-1以單體形式存在。經(jīng)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)，Ad-VT 組細(xì)胞紅色熒光值隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低。對(duì)細(xì)胞熒光值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與 Control 組相比，Ad-VT 組細(xì)胞紅色熒光值/綠色熒光值顯著降低(P<0.01)，說明線粒體膜電位發(fā)生顯著變化，即 Ad-VT引起A549-CSC細(xì)胞線粒體膜電位降低，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。以上結(jié)果表明重組溶瘤腺病毒Ad-VT能夠通過線粒體途徑誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞凋亡。

A.流式細(xì)胞儀分析A549-CSC細(xì)胞凋亡；B.對(duì)A549-CSC 細(xì)胞的凋亡定量結(jié)果

2.4 Ad-VT抑制肺癌干細(xì)胞遷移使用Transwell遷移試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的遷移能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。對(duì)遷移細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色，穿膜細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖4 所示，Ad-Mock 組與 Control 組細(xì)胞隨著時(shí)間延長(zhǎng)，穿膜細(xì)胞逐漸增多；Ad-VT作用A549-CSC后，穿膜細(xì)胞逐漸減少，Ad-VT 組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于Ad-Mock 組與 Control 組(P<0.01)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-VT 組細(xì)胞吸光度值顯著小于 Control 組(P<0.01)，即其穿膜細(xì)胞顯著少于 Control 組，說明Ad-VT抑制了A549-CSC 細(xì)胞的遷移能力。

A.JC-1染色后通過熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化;B.A549-CSC細(xì)胞的JC-1染色定量結(jié)果;C.A549-CSC細(xì)胞線粒體膜電位變化

A.遷移穿膜細(xì)胞結(jié)晶紫染色;B.遷移穿膜細(xì)胞數(shù);C.遷移穿膜細(xì)胞吸光度值

2.5 Ad-VT抑制肺癌干細(xì)胞侵襲使用Biocoat侵襲試驗(yàn)對(duì)細(xì)胞的侵襲能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果如圖5所示。對(duì)侵襲穿膜細(xì)胞進(jìn)行結(jié)晶紫染色，穿膜細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，Ad-Mock 組與 Control 組穿膜細(xì)胞逐漸增多；而Ad-VT作用A549-CSC細(xì)胞后，穿膜細(xì)胞逐漸減少，Ad-VT 組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著少于Ad-Mock 組與 Control 組(P<0.01)。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示，Ad-VT 組細(xì)胞吸光度值顯著小于 Control 組(P<0.01)，說明穿膜細(xì)胞顯著少于 Control 組，Ad-VT抑制了A549-CSC 細(xì)胞的侵襲能力。

A.侵襲穿膜細(xì)胞結(jié)晶紫染色;B.侵襲穿膜細(xì)胞數(shù);C.侵襲穿膜細(xì)胞吸光度值

3 討論

盡管化療和放射療法仍然是臨床癌癥治療的主要選擇，但放化療缺乏腫瘤特異性，能夠?qū)е氯矶拘约耙幌盗袊?yán)重的不良反應(yīng)，降低患者的生活質(zhì)量，且如果不進(jìn)行手術(shù)根治性切除，只有少數(shù)癌癥能夠被有效治療。肺癌是嚴(yán)重威脅人類健康的主要惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率居高不下[1]。肺癌干細(xì)胞是肺癌組織內(nèi)存在的一群具有干細(xì)胞樣特性的細(xì)胞，其與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、耐藥和復(fù)發(fā)密切相關(guān)。盡管放化療能夠破壞大部分腫瘤塊，但仍有一部分癌癥干細(xì)胞可以存活并促進(jìn)癌癥復(fù)發(fā)，從而導(dǎo)致侵襲性和對(duì)療法的抵抗力[4-6]。開發(fā)誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞選擇性和程序性死亡的治療方法至關(guān)重要。重組 DNA 技術(shù)是研究病毒生物學(xué)的重要工具，從而推進(jìn)了針對(duì)癌癥的生物療法。溶瘤病毒代表著一類新的癌癥治療方法,具有極大的靈活性。作為基因治療和溶瘤病毒的媒介物，腺病毒是流行的基因傳遞載體。

重組溶瘤腺病毒Ad-VT能夠誘導(dǎo)肺癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞凋亡[3，7-9]，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑主要是通過線粒體途徑[10-11]。Ad-VT不僅能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對(duì)腫瘤干細(xì)胞也具有抑制作用，能夠誘導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞凋亡從而殺傷細(xì)胞，并且能夠抑制乳腺癌干細(xì)胞的遷移侵襲功能，降低乳腺癌干細(xì)胞的比例[12]。本研究使用重組溶瘤腺病毒Ad-VT感染肺癌干細(xì)胞A549-CSC后，細(xì)胞存活率逐漸降低，線粒體膜電位顯著降低，細(xì)胞凋亡率隨Ad-VT感染時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增高。對(duì)A549-CSC細(xì)胞的遷移及侵襲功能檢測(cè)結(jié)果同樣提示，Ad-VT能夠抑制肺癌干細(xì)胞的遷移侵襲功能。癌癥干細(xì)胞參與癌癥發(fā)展的所有階段，包括原發(fā)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及癌癥的復(fù)發(fā)。Ad-VT能夠殺傷肺癌干細(xì)胞，誘導(dǎo)肺癌干細(xì)胞發(fā)生線粒體途徑的凋亡以及抑制其遷移侵襲能力，經(jīng)過 Ad-VT針對(duì)肺癌干細(xì)胞的治療，將使肺癌干細(xì)胞失去在肺癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)中發(fā)揮作用的能力。