鴨疫里默氏桿菌三磷酸甘油醛脫氫酶與鴨血漿蛋白的結合作用

高繼業(yè)，彭俊杰，耿淑炎，黃 偉，黎容紅，李德龍，陳思懷

(1.西南大學 動物醫(yī)學院，重慶 402460；2.西南大學 醫(yī)學研究院免疫學研究中心，重慶 402460；3.重慶更尚科技有限公司，重慶 402460)

鴨疫里默桿菌(Riemerellaanatipestifer，R.anatipestifer)可感染鴨、鵝、火雞及其他鳥類等多種動物，出現(xiàn)全身漿膜的纖維素性滲出，產(chǎn)生肝周炎、心包炎和氣囊炎等特征性病理變化[1]。R.anatipestifer血清型的多樣性和不斷增強的耐藥性使之成為當前危害我國養(yǎng)鴨業(yè)最為嚴重的病原之一[2-5]。盡管關于R.anatipestifer的研究報道很多，但主要是全基因組和致病因子方面的研究。其中，GenBank登錄的R.anatipestifer全基因組序列多達33個以上，致病因子包括三磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G-APDH)、協(xié)同溶血素(CAMP)、毒力相關蛋白(VapD)、外膜蛋白(OmpA)、明膠酶、載鐵體相互作用蛋白和鐵依賴抑制因子等[6-14]。盡管如此，關于R.anatipestifer導致感染鴨發(fā)生急性炎性滲出反應的可能機制尚未見報道。

纖溶酶原是纖維蛋白溶解酶的無活性前體，可被組織型纖溶酶原激活物、尿激酶型纖溶酶原激活物以及激肽釋放酶和凝血酶等激活，溶解血液中的血纖維蛋白，進而發(fā)揮抗凝血效應[15]。另外，纖維蛋白原是血纖維蛋白的前體，被凝血酶激活后參與完成血液的凝固過程。當動物血液中纖溶酶原和纖維蛋白原水平發(fā)生異常時，血液的凝固/纖溶系統(tǒng)機能可能會發(fā)生紊亂，進而促發(fā)急性或進行性炎性滲出反應。目前關于鴨血液凝固/纖溶系統(tǒng)還知之甚少，是否也存在與哺乳動物相似的纖溶酶原或纖維蛋白原尚需證實。

前期研究發(fā)現(xiàn)，R.anatipestifer能產(chǎn)生具有酶活性的GAPDH同源體RaGAPDH，此同源體與惡性瘧原蟲的GAPDH具有相似的生物學功能，能與人源和兔源纖溶酶原和纖維蛋白原發(fā)生結合[14]。但RaGAPDH能否與鴨血液凝固/纖溶系統(tǒng)中的物質發(fā)生相互作用，能否對鴨血液循環(huán)系統(tǒng)的凝固/纖溶機能產(chǎn)生不利影響，都還需要進一步證實。為此，本研究擬對R.anatipestifer感染鴨的血漿蛋白進行比較分析，并采用Dot-ELISA、Western blot和質譜技術分析可能與RaGAPDH發(fā)生結合的血漿蛋白成分，期望通過本研究探討引發(fā)R.anatipestifer感染鴨發(fā)生炎性滲出反應的分子基礎及可能機制，為闡明R.anatipestifer感染致病的分子機理奠定基礎，對預防與控制R.anatipestifer感染具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株R.anatipestifer血清Ⅰ型、Ⅱ型菌株SC、AF均由本研究室分離、鑒定凍干保存；重組表達菌BL21(pET-28a+-gap)由本研究室構建、保存。

1.2 主要試劑胰蛋白胨大豆肉湯(trypticase soybean broth，TSB)、胰蛋白胨大豆瓊脂(trypticase soy agar，TSA)為OXOID公司產(chǎn)品；丙烯酰胺、β-巰基乙醇、TEMED、過硫酸銨、溴酚藍、考馬斯亮藍R-250和Western blot試劑盒為上海生工生物工程公司產(chǎn)品；IPTG、氨芐青霉素、卡拉霉素為重慶鼎國生物試劑有限公司產(chǎn)品；改良Bradford蛋白定量試劑盒為Vazyme公司產(chǎn)品；蛋白純化試劑盒BeaverBeadsTMIDA-Ni為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗動物及R.anatipestifer感染模型的建立取R.anatipestiferAF株、SC株凍干菌種，劃線接種于TSA平板；挑取平板上長出的單個菌落接種到TSB肉湯，以160 r/min 37℃空氣浴振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期中期,調節(jié)菌體濃度至109CFU/mL備用。1日齡非免健康四川麻鴨(購自重慶天彬禽苗孵化場)在生物隔離器內模擬實際給予光照及充足飲水和飼料，飼養(yǎng)至20日齡行腿部肌肉注射方式分別接種預先準備好的菌懸液(0.4 mL/只)；待被接種鴨出現(xiàn)明顯發(fā)病癥狀，經(jīng)病原學鑒定無誤后無菌采集抗凝血，分離血漿分裝后置于-20℃下保存?zhèn)溆?。同時設注射TSB非感染組作為對照組。

1.4 感染鴨血漿蛋白SDS-PAGE分析及質譜鑒定取感染組、非感染組動物血漿，經(jīng)改良Bradford法進行血漿總蛋白定量后以0.15 mol/L PBS(pH 7.2)作適當稀釋；參照《分子克隆實驗指南》進行SDS-PAGE電泳分析(分離膠、濃縮膠濃度分別為10%、5%)。切下2組動物血漿蛋白差異條帶，低溫保存送至上海生工生物工程公司作質譜鑒定。

1.5 重組RaGAPDH的分離純化及多克隆抗體的制備取參考文獻[14]中構建的重組表達菌E.coliBL21(含重組質粒pET-28a+-gap)，經(jīng)0.5 mmol/L IPTG、37℃下誘導3 h后獲得可溶性重組RaGAPDH。重組RaGAPDH經(jīng)BeaverBeadsTMIDA-Ni顆粒純化、SDS-PAGE分析后采用改良Bradford法進行蛋白定量分析，同時送至上海生工做蛋白質質譜鑒定，并對重組RaGAPDH酶活性進行鑒定。

取適量重組RaGAPDH與弗氏佐劑混合制成免疫抗原，按常規(guī)免疫程序接種健康青年大耳白兔，基礎免疫后加強免疫2次。于最后1次免疫7 d后無菌采血，分離血清，經(jīng)雙向瓊脂擴散試驗測定其效價后分裝低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白成分作用的Dot-ELISA分析采用Dot-ELISA法對重組RaGAPDH與健康鴨血漿蛋白成分的結合作用進行分析，具體程序如下：取1 μL作適當稀釋的健康鴨血漿滴于1 cm2的PVDF膜上，經(jīng)37℃孵育30 min后以0.15 mol/L PBS(pH 7.2)洗滌3次，除去未吸附的血漿蛋白；將PVDF膜用TBS(含5%脫脂奶粉)封閉過夜后與純化的重組RaGAPDH蛋白溶液(10 mg/L)室溫孵育1 h，再用TBST(含0.05%吐溫-20)緩沖液洗滌去除未結合的重組蛋白；將洗滌后的PVDF膜置含兔抗重組RaGAPDH多克隆抗體的封閉液中，室溫孵育1 h；以同樣的TBST洗滌3次，與HRP標記的羊抗兔IgG二抗(1∶4 000稀釋)于室溫下孵育1 h，經(jīng)TBST洗滌3次后以DAB顯色。同時設立不包被血漿蛋白的陰性對照和僅包被重組RaGAPDH陽性對照。

1.7 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白成分結合作用的Western blot分析取保存?zhèn)溆玫难獫{，經(jīng)適當稀釋后進行SDS-PAGE電泳。電泳完畢后取下凝膠，參照試劑盒說明書進行Western blot，分析重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白成分的結合作用情況。

2 結果

2.1 重組RaGAPDH的表達與純化取經(jīng)誘導的重組表達菌BL21(pET-28a+-gap)進行SDS-PAGE分析,圖譜顯示：gap基因獲得可溶性表達，蛋白相對分子質量約為36.7 kDa(圖1)，與預期大小相符。

A.重組蛋白表達(1.IPTG誘導的重組菌裂解上清；2.未經(jīng)IPTG誘導的重組菌；3.IPTG誘導的重菌);B.重組蛋白表達(1.BeaverBeadsTM IDA-Ni純化的重組RaGAPDH；M.蛋白Marker)

純化的重組蛋白進行質譜鑒定和定量分析，結果顯示，獲得的蛋重組蛋白為RaGAPDH，含量為1.46 g/L(圖2)。純化產(chǎn)物與弗氏佐劑混合后免疫大白兔，獲得的多克隆抗體效價為1∶128。

圖2 重組RaGAPDH質譜分析

2.2 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白成分結合作用Dot-ELISA分析健康鴨血漿包被到PVDF膜后，再分別與重組RaGAPDH、兔抗重組RaGAPDH多克隆抗體(瓊擴效價1∶16)及HRP標記羊抗兔IgG(1∶1 000)孵育、DAB顯色，結果顯示，試驗組和陽性對照組的顯色反應均呈陽性，陰性對照組1和2的顯色反應均呈陰性(表1，圖3)。

表1 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白作用Dot-ELISA分析

A.試驗組；B.陽性對照1；C.陰性對照1；D.陰性對照2

2.3 重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白作用Western blot分析及質譜鑒定健康鴨血漿蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后濕轉至PVDF膜，分別與重組RaGAPDH、一抗、HRP標記二抗進行孵育、顯色，結果顯示，在97.2，66.4 kDa附近的2條蛋白條帶與重組RaGAPDH的作用呈陽性(圖4)。切下陽性反應蛋白條帶，低溫保存送至上海生工生物工程公司進行質譜鑒定，分別為纖溶酶原和富含組氨酸糖蛋白。

2.4R.anatipestifer感染動物血漿蛋白的SDS-PAGE分析及質譜鑒定取感染鴨血漿，經(jīng)蛋白定量后進行SDS-PAGE電泳分析。電泳圖譜顯示，AF、SC菌株感染組均與非感染對照組間存在5條差異蛋白條帶，分別命名為U1、U2、U3、U4、D1(表2,圖5)。利用Quantity One軟件對電泳圖譜上差異蛋白條帶進行灰度分析，2個感染組U1、U2、U3、U4蛋白條帶含量較對照組顯著升高(P<0.01)，D1蛋白條帶含量較對照組顯著降低(P<0.05)，AF、SC菌株感染組間的蛋白條帶差異不顯著(P>0.05)。

A.纖溶酶原;B.富含組氨酸糖蛋白;1.重組RaGAPDH；2.一抗；3.HRP標記二抗；M.蛋白Marker

將5條差異顯著蛋白條帶U1、U2、U3、U4、D1分別回收后送上海生工生物工程公司進行質譜分析(表2)。結果顯示，U1為α2-M或血漿銅藍蛋白，U2為補體3d(C3d)，U3為α-1-酸性類糖蛋白、纖維蛋白原-α鏈，U4可能為α-1-酸性類糖蛋白，D1為富含組氨酸糖蛋白。

A.AF感染組；S.SC感染組；N.對照組；U1～U4.差異蛋白條帶U1、U2、U3、U4灰度分析；D1.差異蛋白條帶D1灰度分析

表2 感染鴨血漿差異蛋白的質譜分析

3 討論

3.1 RaGAPDH可能引發(fā)鴨血液抗凝血能力下降R.anatipestifer能產(chǎn)生和分泌具有酶活性的GAPDH同源體RaGAPDH，該同源體能與人源和兔源纖溶酶原和纖維蛋白原發(fā)生結合，據(jù)此推測RaGAPDH可能參與動物血液循環(huán)系統(tǒng)機能紊亂過程[14]。為此，本研究采用Dot-ELISA和Western blot方法研究重組RaGAPDH與鴨血漿蛋白的相互作用，可能對鴨血液凝固/纖溶系統(tǒng)機能產(chǎn)生的影響。Dot-ELISA和Western blot研究結果顯示，RaGAPDH可與鴨血漿蛋白發(fā)生結合作用，經(jīng)質譜分析發(fā)現(xiàn)其主要成分為纖溶酶原和HRG。血纖溶酶是動物血液循環(huán)系統(tǒng)中保障血液凝固/纖溶系統(tǒng)機能正常發(fā)揮的重要成員，可被組織型纖溶酶原激活物、尿激酶型纖溶酶原激活物、FⅫa以及激肽釋放酶和凝血酶等激活，溶解血纖維蛋白，發(fā)揮抗凝血效應[15]。本研究中RaGAPDH與纖溶酶原結合，可能會抑制纖溶酶原激活，無法發(fā)揮溶解血纖維蛋白的生物學效應，致使血液中纖維蛋白/(原)含量增高，血液凝固/纖溶系統(tǒng)平衡被打破，凝血機能亢進，血液循環(huán)障礙。結合黎德兵等[16]對雛鴨感染R.anatipestifer的病理學研究發(fā)現(xiàn)感染鴨實質器官出現(xiàn)嚴重腫大和彌漫性充血，故推測RaGAPDH與纖溶酶原的結合致動物血液纖溶系統(tǒng)的抗凝血機能下降，血液循環(huán)發(fā)生障礙。另外，HRG是一種富含組氨酸的多功能活性蛋白，可與肝素、纖溶酶(原)、纖維蛋白(原)、血小板和單核細胞發(fā)生結合，對血液凝固系統(tǒng)與纖溶系統(tǒng)發(fā)揮重要的調節(jié)作用。RaGAPDH對鴨HRG的結合必然導致鴨血液凝固/纖溶系統(tǒng)的調節(jié)能力下降，平衡極易被打破。綜上所述，RaGAPDH可與鴨血漿蛋中的纖溶酶原和HRG發(fā)生結合，這種結合可能導致鴨血液纖溶系統(tǒng)的抗凝血能力下降。

3.2R.anatipestifer感染導致動物血液凝固/纖溶系統(tǒng)平衡能力下降α2-M是存在于正常人體、鳥類、爬行類及兩棲類動物的血液和其他組織內的一種非特異性蛋白酶抑制劑，主要由肝細胞合成并分泌。血液中的α2-M可與血纖維蛋白溶解酶和凝血酶發(fā)生不可逆結合，發(fā)揮促凝血或抗凝血作用，進而參與凝血平衡、纖溶激肽系統(tǒng)調節(jié)等一系列生理及病理過程[17-19]。研究結果顯示，R.anatipestifer感染鴨血漿α2-M含量水平顯著增高，表明R.anatipestifer感染導致動物血液凝固/纖溶系統(tǒng)的平衡能力下降。另外，R.anatipestifer感染還導致了鴨血漿中HRG含量顯著下降，是否因其表達分泌的RaGAPDH與之結合有關還有待進一步研究證實，但是血漿HRG含量的顯著下降必然也會導致動物血液凝固/纖溶系統(tǒng)的平衡調節(jié)能力下降。

3.3R.anatipestifer感染引發(fā)動物肝臟急性炎性反應和嚴重損傷α1-AG主要是由肝臟巨噬細胞和粒細胞合成并分泌的一種十分穩(wěn)定的急性時相蛋白。在正常情況下，動物血漿中的含量較低，當處在急性感染、炎癥等病理狀態(tài)下，α1-AG水平會升高[20]。因此，人醫(yī)臨床上常將α1-AG作為急性細菌感染的標志和肝病檢測的重要指標，且其含量水平與肝病變的范圍和損害程度明顯相關。本研究中感染鴨血漿α1-AG含量顯著增高，據(jù)此進一步證實R.anatipestifer感染會引發(fā)動物肝臟發(fā)生急性炎性反應和嚴重損傷。

綜上所述，重組RaGAPDH可與鴨血漿中的纖溶酶原和HRG發(fā)生結合，R.anatipestifer感染鴨血漿α2-M和α1-AG含量顯著增高(P<0.05),HRG含量顯著下降(P<0.05)。研究結果表明，R.anatipestifer產(chǎn)生的具有酶活性的GAPDH同源體RaGAPDH能與動物血漿纖溶酶原和HRG發(fā)生結合，這種結合可能導致其血液凝固系統(tǒng)/纖溶系統(tǒng)的平衡出現(xiàn)紊亂和抗凝血機能下降；R.anatipestifer感染可引發(fā)動物肝臟急性炎性反應和嚴重損傷，及血漿α2-M、α1-酸性糖蛋白含量的顯著增高和HRG含量的顯著下降(P<0.05)，可能導致動物血液凝固系統(tǒng)/纖溶系統(tǒng)平衡的自我調節(jié)能力下降，但能否引發(fā)動物彌漫性血管內凝血和微血栓的形成，以及R.anatipestifer感染引發(fā)的HRG含量水平顯著下降是否與其分泌表達的RaGAPDH有關，還有待進一步研究證實。