大熊貓犬瘟熱抗體間接ELISA方法的初步建立及應用

潘廣林，趙鵬鵬，高更更，雷穎虎，駱 琛，王興龍

(1.秦嶺大熊貓研究中心 珍稀野生動物救護基地，陜西 周至 710402;2.西北農(nóng)林科技大學 動物醫(yī)學院，陜西 楊凌 712100)

作為中國的標志性物種，大熊貓因其特殊的生態(tài)價值和科學價值而受到廣泛的關(guān)注。通過建立自然保護區(qū)及人工繁殖等一系列措施，大熊貓數(shù)量有了較大的增長。但近年來，疾病給大熊貓保護造成嚴重威脅，其中犬瘟熱最嚴重[1-2]。犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一種急性、高致死性傳染病，臨床上以雙相熱、眼鼻黏膜分泌物增多等為主要特征。目前針對該病尚未開發(fā)出特異性的藥物，疫苗免疫是預防犬瘟熱的有效措施。由于缺乏大熊貓專用犬瘟熱疫苗，因此多以犬用疫苗代替。但將該類疫苗用于大熊貓等野生動物存在一定的風險，犬用疫苗免疫后引起大熊貓和其他野生動物死亡或發(fā)生不良反應的案例在國內(nèi)外均有報道[3-6]。雪貂源犬瘟熱重組疫苗是一種新型犬瘟熱疫苗，其安全性已經(jīng)得到驗證[7-9]，但由于缺少犬瘟熱血清學檢測方法，其免疫效果需要進一步研究確定。

對大熊貓全基因組及IgG重鏈的分析表明，大熊貓與犬的基因組最接近[10-11]，提示抗犬IgG二抗具有可替代抗大熊貓IgG二抗用于大熊貓疾病血清檢測的可能。葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal protein A，SPA)作為金黃色葡萄球菌細胞壁上的蛋白成分，能與大多數(shù)動物的IgG Fc片段非特異性結(jié)合，可替代傳統(tǒng)酶標二抗用于傳染病的診斷[12]，但SPA能否用于大熊貓疾病的血清學檢測尚不明確。本研究以CDV H和F蛋白的短肽作為包被抗原，用實驗室制備的抗大熊貓IgG Fc二抗、商品化的抗犬IgG二抗及SPA做二抗，探究3種二抗應用于大熊貓犬瘟熱血清學檢測的可行性，并以建立的方法評估大熊貓的免疫效果。

1 材料與方法

1.1 多肽和血清CDV H和F蛋白多肽由合肥國肽生物公司合成；大熊貓血清(免疫犬瘟熱疫苗2周后采集，間隔9個月)由陜西省林業(yè)科學院珍稀野生動物救護基地提供。

1.2 主要試劑和材料HRP標記的鼠抗大熊貓IgG Fc二抗由實驗室前期制備保存；HRP標記的兔抗犬IgG二抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；HRP標記的SPA購自博士德生物工程有限公司；TMB顯色液購自北京索萊寶科技有限公司；CDV抗體ELISA 檢測試劑盒購自上海加科生物科技有限公司。

1.3 最適包被質(zhì)量濃度的確定利用方陣滴定法確定最適包被濃度。將CDV多肽以50 mg/L的起始質(zhì)量濃度，2倍倍比稀釋包被于酶標板，100 μL/孔，37℃孵育2 h。PBST洗滌3次，以10%的脫脂乳封閉2 h。PBST洗滌3次，獲得包被好的反應板。

將大熊貓血清以1∶50的起始濃度包被于酶標板，37℃孵育1 h。PBST洗滌5次，加入HRP標記的鼠抗大熊貓IgG Fc二抗(100 μL，1∶1 000稀釋)。PBST洗滌5次，加入50 μL TMB，37℃顯色15 min，加入50 μL終止液，反應結(jié)束后測定陽性血清和陰性血清D450比值(P/N)，確定抗原和血清的最適包被濃度。

1.4 酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)的確定將大熊貓血清1∶100稀釋后包被于酶標板，HRP標記的鼠抗大熊貓IgG Fc二抗和HRP標記的兔抗犬IgG二抗做1∶1 000～1∶4 000的2倍倍比稀釋，HRP標記的SPA做1∶500～1∶2 000的2倍倍比稀釋，反應結(jié)束后測定D450值，確定酶標二抗的最佳稀釋倍數(shù)。

1.5 符合率試驗確定抗原、血清最適包被濃度以及酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)后，利用建立的3種ELISA方法和商品化犬瘟熱抗體試劑盒對12份大熊貓犬瘟熱疫苗首免血清進行檢測，比較3種方法和商品化犬瘟熱抗體試劑盒檢測結(jié)果的一致性。

1.6 敏感性試驗在最佳反應條件下，對2倍倍比稀釋的大熊貓陽性血清和陰性血清(1∶100～1∶12 800)進行檢測，反應結(jié)束計算P/N，比較3種二抗用于大熊貓犬瘟熱抗體檢測的敏感性。

1.7 重復性試驗利用建立的3種ELISA檢測方法對12份血清進行批內(nèi)和批間重復性試驗，批內(nèi)試驗和批間試驗均做3個重復，計算批內(nèi)和批間差異的變異系數(shù)。

1.8 血清抗體檢測根據(jù)上述試驗確定的抗原、血清和酶標二抗的最適反應濃度，利用建立的3種ELISA方法對前后2次犬瘟熱疫苗免疫的大熊貓血清進行檢測，計算3種方法測得的二免與首免D450差值的平均值，得出免疫前后血清抗體水平的變化。

2 結(jié)果

2.1 最適包被質(zhì)量濃度的確定根據(jù)反應結(jié)束D450和P/N值的最大值，確定最適抗原包被質(zhì)量濃度為25 mg/L，血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶100(圖1)。

圖1 最適包被質(zhì)量濃度的確定

2.2 酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)的確定將倍比稀釋的3種酶標二抗與大熊貓血清反應，確定D450值最大時對應的稀釋度為其最佳稀倍數(shù)，抗大熊貓二抗、抗犬二抗、SPA的最佳稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000，1∶1 000，1∶500(圖2)。

2.3 符合率試驗檢測12份免疫犬瘟熱疫苗的大熊貓血清，結(jié)果顯示鼠抗大熊貓二抗、兔抗犬二抗、SPA和商品化犬瘟熱抗體試劑盒(犬用)4種方法檢測的陽性率分別為100%,92%,100%,50%。表明建立的3種ELISA檢測方法符合率較高，一致性較好，陽性檢出率遠高于商品化試劑盒(圖3,表1)。

2.4 敏感性試驗將3種檢測方法在P/N值≥2.1時對應的血清最大稀釋度確定為該檢測方法的敏感性，分別為1∶400，1∶100，1∶100(圖4)。

圖2 酶標二抗最佳稀釋倍數(shù)的確定

圖3 3種檢測方法一致性比較

表1 3種檢測方法和商品化試劑盒一致性比較

圖4 3種檢測方法的敏感性試驗

2.5 重復性試驗利用鼠抗大熊貓二抗、兔抗犬二抗和SPA建立的檢測方法批內(nèi)重復性試驗的變異系數(shù)分別為0.06%～8.06%,0.16%～8.04%,2.27%～4.92%;批間重復性試驗的變異系數(shù)分別為0.70%～9.26%,0.90%～8.52%,0.65%～8.87%，表明3種檢測方法的重復性較好(表2)。

表2 3種檢測方法的重復性試驗 %

2.6 血清抗體檢測結(jié)果前后2次免疫過犬瘟熱疫苗的大熊貓血清抗體檢測結(jié)果顯示，二免過后， 50%(6/12)的個體抗體水平升高0.2以上，25%(3/12)的個體抗體水平升高0.1～0.2，25%(3/12)的個體抗體水平升高0.1以下(圖5)。

圖5 大熊貓2次免疫犬瘟熱疫苗抗體水平變化

3 討論

犬瘟熱是由CDV引起的一種急性高致死性疾病，該病目前在全世界廣泛流行，在中國主要流行的基因型是亞洲-1型[13-14]。自然條件下CDV主要感染包括犬科、鼬科、貓科在內(nèi)的多種食肉目動物，但近年來CDV的宿主范圍不斷擴大，已經(jīng)嚴重威脅到大熊貓的生存[1,2,15]。CDV是副黏病毒科、麻疹病毒屬的一種有囊膜的單股負鏈RNA病毒[16]，基因組全長15 690 nt，分別編碼核衣殼蛋白(nucleocapsid protein，N)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、基質(zhì)蛋白(matrix protein，M)、融合蛋白(fusion protein，F(xiàn))、血凝素蛋白(hemagglutinin protein，H)、大聚合酶蛋白(large protein，L)6個蛋白[17]。H和F蛋白上存在許多抗原表位[18]，免疫原性較好，在抗感染免疫和誘導中和抗體的產(chǎn)生等方面發(fā)揮著重要作用[19-20]。梅里亞公司已研發(fā)出雪貂源的犬瘟熱H和F蛋白金絲雀痘病毒重組活載體疫苗，該疫苗安全性已得到廣泛驗證。國外研究人員曾對來自中國的2只大熊貓免疫該重組疫苗并監(jiān)測其抗體的動態(tài)變化，結(jié)果表明該疫苗可以誘導機體產(chǎn)生較高水平的中和抗體，能為大熊貓?zhí)峁?年的免疫保護[9]。近期一項針對5只大熊貓免疫該疫苗后的血液轉(zhuǎn)錄組研究結(jié)果表明，該疫苗主要通過固有免疫應答和細胞免疫來發(fā)揮免疫保護作用，缺乏足夠的記憶細胞維持長期免疫[21]。

通過將鼠抗大熊貓IgG Fc二抗、兔抗犬IgG二抗和SPA應用于大熊貓犬瘟熱間接ELISA診斷，結(jié)果表明3種二抗均可用于大熊貓犬瘟熱抗體的血清學檢測，建立的3種檢測方法對于樣本的檢測結(jié)果趨于一致，相比商品化試劑盒具有更高的準確性。利用大熊貓二抗建立的診斷方法敏感性更高，可作為首選二抗，但在缺乏大熊貓二抗時可選擇另外2種二抗進行替代。通常認為，犬瘟熱的抗體達到1∶100就具備對犬的完全免疫保護力，但對大熊貓是否具有免疫保護尚缺乏足夠的試驗論證。對大熊貓前后2次疫苗免疫的血清抗體監(jiān)測結(jié)果表明，12只大熊貓在2次免疫后都產(chǎn)生了超過1∶100的中和抗體，但針對犬瘟熱金絲雀痘病毒重組活載體疫苗的免疫應答，無論首免還是二免，都存在不同程度的個體差異，二免后僅有50%的個體產(chǎn)生了更強的再次免疫應答，提示在實際免疫過程中應根據(jù)不同個體制定免疫程序。由于間接ELISA的影響因素較多，無法對其試驗條件逐一進行優(yōu)化，本研究中建立的檢測方法尚有一定的局限性，后續(xù)仍需做進一步的改進。

本研究對鼠抗大熊貓IgG Fc二抗、兔抗犬IgG二抗以及SPA用于大熊貓犬瘟熱抗體血清學檢測的可行性進行了試驗論證，初步建立了針對大熊貓犬瘟熱的血清學檢測方法，完成了對大熊貓前后2次疫苗免疫血清抗體水平的評估，對大熊貓犬瘟熱血清學檢測試劑盒的開發(fā)、疫苗免疫效力的評估以及犬瘟熱防控水平的提升具有重要意義。