區(qū)分NDV強(qiáng)弱毒株的抗雞新城疫病毒La Sota株NP蛋白單克隆抗體1E3的制備與鑒定

王賽楠，李利杰，趙振超，孫文杰，張世華，何春輝，李新生

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

雞新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的禽類的一種急性、高度接觸性、傳染性疫病[1]，其主要癥狀為高熱，精神沉郁，呼吸加快，食欲減退，下痢，以及翅、腿麻痹，運(yùn)動失調(diào)等[2]，該病傳播快、發(fā)病率和死亡率高，世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為A類動物疫病[3]。自1926年被報(bào)道以來，ND在世界范圍內(nèi)廣泛傳播，伴隨著疫苗的廣泛應(yīng)用，ND的毀滅性大流行已基本得到控制[4]，因?yàn)槿狈^(qū)域性協(xié)調(diào)的NDV綜合防控策略，其在全球主要養(yǎng)雞地區(qū)雞群仍時有發(fā)生。

NDV屬于副黏病毒科副黏病毒屬的禽副黏病毒Ⅰ型，是具囊膜的負(fù)鏈RNA病毒，僅有1個血清型[5]。ND的確診常常使用病毒分離鑒定、RT-PCR、血凝試驗(yàn)(HA)和血凝抑制試驗(yàn)(HI)等，但這些方法均難以區(qū)分分離到的NDV是流行強(qiáng)毒株還是是弱毒疫苗株[6]。單克隆抗體有潛力作為NDV不同毒株抗原性差異區(qū)分的重要鑒別手段[7-8]。區(qū)分NDV毒力強(qiáng)弱的常用方法是測定NDV分離毒株的腦內(nèi)致病指數(shù)(ICPI)，結(jié)合F2蛋白羧基端113～116位是否含有至少3個精氨酸或者賴氨酸，F(xiàn)1蛋白的第117位是否為苯丙氨酸來進(jìn)行綜合判定[9]。到目前為止，尚未見顯著區(qū)分NDV強(qiáng)、弱毒單克隆抗體制備和鑒定的報(bào)道。本課題組為建立快速區(qū)分NDV強(qiáng)毒和弱毒疫苗株病毒的檢測方法，進(jìn)行相關(guān)探索和研究。

1 材料與方法

1.1 病毒、實(shí)驗(yàn)動物和主要試劑NDV La Sota株(基因Ⅱ型，ICPI=0.3)、F48E9株(基因Ⅸ型，ICPI=2.0)、HN09-68株(基因Ⅶ型，ICPI=1.5)、AIV H9N2亞型X-13株、IBDV C4株、FAdV-4 WZ株、NS0細(xì)胞均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)鑒定保存；BALB/c小鼠購自鄭州大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心；SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司；弗氏佐劑、HAT培養(yǎng)基等購自Sigma公司。

1.2 病毒的增殖和濃縮純化采用雞胚尿囊腔接種法增殖NDV La Sota株，收獲尿囊液，4℃，3 000 r/min離心30 min，棄沉淀，取上清4℃，20 000 r/min離心2 h，沉淀以適量PBS緩沖液重懸，10%～60%蔗糖連續(xù)密度梯度，38 000 r/min離心4 h，收集病毒液，脫糖，檢測HA效價，作為免疫原，-70℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物免疫用0.1%的甲醛滅活上述純化的La Sota病毒，與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，皮下分點(diǎn)接種6周齡BALB/c小鼠2只，0.2 mL/只。二免和三免用弗氏不完全佐劑制備，每次接種0.2 mL/只。免疫間隔為2周。三免后1周，斷尾采血，測定血清效價，達(dá)到要求后，于融合前3 d以病毒液腹腔接種加強(qiáng)免疫。

1.4 間接ELISA方法的初步建立按照棋盤法倍比稀釋La Sota株病毒抗原和對照血清，確定最佳抗原稀釋倍數(shù)、陽性血清稀釋倍數(shù)，建立間接ELISA方法。隨機(jī)選取未免疫的健康小鼠10只，斷尾，采集陰性血清。在最佳ELISA條件下，計(jì)算陰陽臨界值(陰陽臨界值=陰性標(biāo)本D450平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差)。

1.5 小鼠血清效價的測定將待檢小鼠斷尾采血，用建立的間接ELISA方法檢測抗體效價。

1.6 細(xì)胞融合按照文獻(xiàn)[10]方法，無菌采集免疫小鼠的脾臟，研磨分離成單個脾細(xì)胞，與NS0進(jìn)行融合。將細(xì)胞懸液加入有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔HAT選擇性培養(yǎng)基細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37℃、5% CO2培育箱中培養(yǎng)。

1.7 陽性雜交瘤細(xì)胞的篩選及亞克隆培養(yǎng)10～14 d時，選擇只有單個細(xì)胞群落的細(xì)胞孔，吸取培養(yǎng)液，檢測其ELISA效價。對陽性單克隆細(xì)胞用有限稀釋法進(jìn)行3次亞克隆。穩(wěn)定分泌特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)、凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.8 腹水的制備和純化取12周齡經(jīng)產(chǎn)BALB/c母鼠，腹腔注入無菌液體石蠟，0.5 mL/只。7～10 d后每只小鼠腹腔注射1.0×106個雜交瘤細(xì)胞。連續(xù)觀察，待小鼠腹部明顯膨大有波動感時，用穿刺針無菌收集腹水，離心取上清，親和層析法純化，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.9 單抗效價的測定用上述間接ELISA方法測定單克隆雜交瘤上清液和純化單抗效價。

1.10 雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定性檢測將雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)10代以上，凍存，2個月后復(fù)蘇，然后再連續(xù)傳至10代，用建立的間接ELISA方法檢測其效價。

1.11 單抗特異性鑒定分別用AIV H9N2亞型X-13株、IBDV C4株、FAdV-4 WZ株包被96孔酶標(biāo)板，采用間接ELISA方法鑒定各株單抗反應(yīng)特異性，用本研究制備的單克隆抗體作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，測定篩選鑒定的陽性單抗與上述參考病毒的反應(yīng)性。

1.12 單抗中和活性測定將NDV La Sota株雞胚尿囊液用PBS緩沖液進(jìn)行10-5，10-6，10-7，10-8稀釋，分別與等體積的純化單抗混合，37℃作用1 h，與不加單抗的病毒稀釋液，各尿囊腔接種10日齡SPF雞胚，0.2 mL/枚，37℃培養(yǎng)96 h后收集接種雞胚的尿囊液，測定HA效價，檢測單抗的中和效果。

1.13 單抗亞型鑒定按照IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit說明書，對獲得的單克隆抗體進(jìn)行亞型鑒定。

1.14 陽性單抗與不同毒力NDV的結(jié)合能力鑒定按照1.4中的抗原最佳包被濃度，用NDV La Sota株、F48E9株和HN09-68株純化病毒液分別包被96孔酶標(biāo)板，用上述陽性單抗作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，TMB顯色，測定D450值，判定單抗與不同毒力NDV毒株的結(jié)合特性。

1.15 Western blot鑒定將純化的La Sota病毒進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，分別使用1E3、7A8、8F11作為一抗，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG作為二抗，DAB避光顯色10 min，確定一抗對應(yīng)的目的帶。

1.16 蛋白鑒定收集純化Western blot中單抗對應(yīng)的目的蛋白，送生工生物工程有限公司進(jìn)行二級質(zhì)譜測定。

2 結(jié)果

2.1 間接ELISA方法的初步建立將純化后的La Sota株抗原用碳酸鹽緩沖液分別稀釋為54.8，27.4，13.7，6.9 mg/L，包被酶標(biāo)板。使用SPF健康小鼠的陰性血清或免疫制備的陽性血清作為一抗，將血清1∶12 800～1∶204 800作倍比稀釋，進(jìn)行ELI-SA檢測，測定結(jié)果見表1。當(dāng)抗原的包被質(zhì)量濃度為13.7 mg/L，血清稀釋度為1∶102 400時，陽性血清D450值最接近1.0，同時P/N>2.0，陰性血清D450值也最低，所以13.7 mg/L為La Sota株最佳包被質(zhì)量濃度。

表1 抗原包被質(zhì)量濃度和血清最佳稀釋倍數(shù)的確定

2.2 陰陽臨界值的確定取10只SPF健康小鼠的血清，按照13.7 mg/L包被酶標(biāo)板，將陰性血清用5%脫脂奶粉稀釋至1∶102 400，測定D450值。10只陰性小鼠血清D450平均值為0.085，標(biāo)準(zhǔn)差為0.015，根據(jù)公式：陰陽臨界值=陰性標(biāo)本D450平均值+3×標(biāo)準(zhǔn)差，陰陽臨界值為0.130。

2.3 陽性雜交瘤細(xì)胞的建立經(jīng)細(xì)胞融合和亞克隆培養(yǎng)，使用上述ELISA方法篩選獲得3株分泌抗NDV La Sota株單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的單抗分別命名為1E3、7A8、8F11。

2.4 陽性雜交瘤細(xì)胞的穩(wěn)定性和單克隆抗體效價的測定將上述3株定株的雜交瘤細(xì)胞株凍存2個月后復(fù)蘇，然后連續(xù)傳至第10代，測定雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清和相應(yīng)腹水的效價(表2)。

2.5 單抗特異性鑒定3株單抗僅與La Sota株包被的酶標(biāo)板呈陽性反應(yīng)，而與AIV H9N2亞型X-13株、IBDV C4株、FAdV-4 WZ株均呈陰性反應(yīng)(表3)，證明3株單抗均具有良好的特異性。

表2 第10代雜交瘤細(xì)胞上清和腹水中不同單抗的ELISA效價

表3 不同單抗與不同包被抗原ELISA測定結(jié)果

2.6 單抗中和活性測定雞胚中和試驗(yàn)結(jié)果(表4)顯示，1E3中和組和8F11中和組與對照組相比，雞胚感染數(shù)量無顯著性差異，對NDV La Sota株無中和活性。7A8中和組，在10-7稀釋度時對NDV La Sota株具有顯著的中和活性。

2.7 單抗亞型鑒定如圖1所示，使用羅氏抗體分型診斷試紙判定1E3和8F11為IgG1亞型，7A8為IgM亞型，其輕鏈均為κ鏈。

2.8 不同單抗與不同毒力NDV結(jié)合能力的鑒定如表5所示，當(dāng)上述純化的單克隆抗體1∶51 200倍稀釋時，只有1E3與La Sota呈強(qiáng)陽性反應(yīng)。使用不同毒力的NDV包被的酶標(biāo)板，1E3與La Sota反應(yīng)的D450值為2.543，呈陽性反應(yīng)，而強(qiáng)毒株F48E9和HN09-68與單克隆抗體的反應(yīng)小于陰陽臨界值，呈陰性反應(yīng)。1E3與弱毒的反應(yīng)和與強(qiáng)毒F48E9、HN09-68的反應(yīng)之間P<0.05，差異性顯著。由此可見，1E3具備區(qū)分NDV強(qiáng)毒和弱毒的能力。

表4 不同單抗對NDV La Sota株雞胚中和試驗(yàn)結(jié)果

圖1 單抗亞型的鑒定

表5 單克隆抗體與不同NDV毒株反應(yīng)

2.9 NDV La Sota株病毒SDS-PAGE電泳、Western blot和二級質(zhì)譜鑒定為識別1E3、7A8、8F11所針對的NDV抗原種類，使用純化的La Sota病毒進(jìn)行SDS-PAGE、Western blot，只有單抗1E3可見穩(wěn)定清晰的結(jié)果(圖2B)，La Sota病毒顆粒中相對分子質(zhì)量約為53.8 kDa與1E3發(fā)生了特異性反應(yīng)。二級質(zhì)譜測定證明該抗原蛋白的一級結(jié)構(gòu)含有LGVEYAQAQGSSINE DMAAELK序列(圖3)，經(jīng)De novo，確認(rèn)該蛋白為La Sota株NP蛋白。

A．純化的La Sota病毒SDS-PAGE分析; B.Western blot分析。M.蛋白Marker；1.空白對照；2．純化的La Sota病毒

圖3 結(jié)合單克隆抗體1E3的蛋白部分片段的二級質(zhì)譜圖

3 討論

多年來，我國一直采用弱毒疫苗聯(lián)合滅活疫苗接種來預(yù)防和控制ND的感染和傳播。由于免疫程序安排不當(dāng)，或者疫苗存放或使用不當(dāng)?shù)?，常致免疫失敗[11]。當(dāng)前，ND仍是我國養(yǎng)禽業(yè)必須預(yù)防的禽類重大疫病之一[12]。臨床診斷中，常分離到NDV，由于ND弱毒疫苗的廣泛使用，很難短時間內(nèi)區(qū)分分離到的NDV是流行的強(qiáng)毒株，還是疫苗弱毒株。

NDV強(qiáng)毒株和弱毒株不同的抗原性是由于強(qiáng)毒株和弱毒株所含抗原表位的差異所致，單克隆抗體可以特異性識別單個抗原表位，常用于NDV抗原差異性的研究[13]。ALEXANDER等[14]對單抗在毒株鑒定和分類方面進(jìn)行了深入研究，應(yīng)用針對病毒表面糖蛋白的單克隆抗體進(jìn)行強(qiáng)毒株的鑒定和分型，以區(qū)別抗原性的變異。本研究篩選獲得3株生長狀態(tài)良好且穩(wěn)定分泌抗NDV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。單抗7A8重鏈為IgM亞型，輕鏈為κ鏈，其對NDV La Sota株有顯著的中和活性，具有重要的臨床治療潛力；1E3與NDV的強(qiáng)毒和弱毒存在截然不同的結(jié)合能力，可與疫苗弱毒株La Sota株發(fā)生強(qiáng)烈的結(jié)合反應(yīng)，而與基因Ⅶ型NDV HN09-68株和經(jīng)典基因Ⅸ型NDV F48E9株結(jié)合反應(yīng)呈陰性?；颌餍偷腘DV是當(dāng)前我國流行的強(qiáng)毒NDV的主要優(yōu)勢基因型。由此可見,1E3具有區(qū)分NDV流行強(qiáng)毒和疫苗弱毒的重要應(yīng)用價值。

經(jīng)SDS-PAGE電泳、Western blot、二級質(zhì)譜測定，證實(shí)1E3對應(yīng)的抗原為NDV的NP蛋白。通常認(rèn)為,NDV的F蛋白裂解位點(diǎn)兩側(cè)堿性氨基酸的含量決定了NDV毒力的強(qiáng)弱[3]。對比NDV弱毒株La Sota株、強(qiáng)毒株F48E9株、HN09-68株的NP蛋白的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)：La Sota株與F48E9株NP蛋白的氨基酸差異有38個氨基酸，La Sota株與HN09-68株NP蛋白的氨基酸差異有46個。胡順林等[15]把NDV強(qiáng)毒株ZJ1株NP蛋白基因替換為中等毒力毒株BC株NP蛋白基因，拯救獲得的重組NDV毒力顯著減弱，可見，NDV毒力的強(qiáng)弱與NDV NP蛋白氨基酸的組成相關(guān)。DORTMANS等[16]也證實(shí)NP蛋白與NDV的毒力密切相關(guān)。提示除F蛋白外，NP蛋白變異氨基酸也可能是NDV毒力強(qiáng)弱分子基礎(chǔ)的重要組成，可以利用能夠識別這種變異的單抗來區(qū)分NDV毒株毒力強(qiáng)弱。

眾所周知，NDV強(qiáng)、弱毒的快速鑒別一直是NDV臨床快速診斷的瓶頸，區(qū)分NDV毒株毒力的強(qiáng)弱，常常需要測定F基因裂解位點(diǎn)特征序列，并進(jìn)行1日齡SPF雞腦內(nèi)致病指數(shù)測定(ICPI)，該方法要求較高，且費(fèi)時費(fèi)力[17]。單抗1E3的發(fā)現(xiàn)，預(yù)示可以利用1E3與疫苗弱毒株La Sota株超強(qiáng)的結(jié)合能力以及與經(jīng)典和現(xiàn)行流行強(qiáng)毒的陰性結(jié)合反應(yīng)的顯著差異，研發(fā)快速診斷試紙或者夾心ELISA試劑盒，豐富NDV分離株毒力強(qiáng)弱的快速區(qū)分診斷工具。