豬圓環(huán)病毒2型和4型雙重PCR檢測(cè)方法的建立

徐 通,侯承堯，田潤(rùn)博,崔建濤,趙 麗，陳紅英*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的一種最小的、無囊膜的、單股環(huán)狀DNA病毒，其全基因組含有1 766～1 779個(gè)堿基[1-2]。豬圓環(huán)病毒病(PCVAD)是由PCV2引起的一系列疾病的總稱，主要包括患斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、仔豬先天性震顫(CT)、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS)、豬呼吸道疾病綜合征(PRDC)以及繁殖障礙疾病[3-6]。自2000年郎洪武等[7]在我國報(bào)道PCV2以來，我國豬群PCVAD頻發(fā)，且死亡率不斷增加，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

2019年ZHANG等[8]報(bào)道在患有PCVAD的豬中發(fā)現(xiàn)了1種新型PCV，命名為豬圓環(huán)病毒4型(PCV4)。該病毒的基因組大小為1 770 nt，其結(jié)構(gòu)與PCV2相似，主要編碼Cap和Rep2個(gè)基因，其中Cap基因?yàn)?87 nt，編碼228個(gè)氨基酸；Rep基因?yàn)?91 nt，編碼296個(gè)氨基酸。TIAN等[9]從患有嚴(yán)重臨床疾病(包括PDNS、腹瀉和呼吸道癥狀)的豬中鑒定出PCV4，表明PCV4與PCVAD密切相關(guān)。

PCV2感染可引起豬免疫抑制，臨床上經(jīng)常出現(xiàn) PCV2 與豬其他病原共感染，使PCVAD的臨床表現(xiàn)變得復(fù)雜，且發(fā)病豬死亡率增加[10-11]。已有多個(gè)研究表明臨床上PCV4常與PCV2混合感染[8-9]。為了監(jiān)控PCVAD疫情，急需建立一種快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、靈敏和特異的PCV2/4檢測(cè)方法。目前PCV2和PCV4已有單一PCR檢測(cè)方法，迄今尚未有同時(shí)檢測(cè)2種病原的方法。因此，本試驗(yàn)建立了一種特異、靈敏且同時(shí)檢測(cè)和鑒別PCV2/4的雙重PCR方法，為監(jiān)測(cè)PCV2/4在我國的發(fā)生與流行提供分子診斷技術(shù)支持，對(duì)于PCV2/4的流行病學(xué)調(diào)查具有重要現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 病毒株和臨床樣品PCV2、偽狂犬病病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬傳染性胃腸炎(TGEV)、大腸桿菌(E.coli)、豬傷寒沙門菌(Salmonellatyphisuis)均保存于鄭州豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。利用本試驗(yàn)室田潤(rùn)博等[12]建立的單一PCR方法對(duì)保存于鄭州豬重大疫病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的病料進(jìn)行PCV4檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)為陽性的病料進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，作為PCV4陽性對(duì)照。

2018—2020年，從河南、山西不同地區(qū)豬場(chǎng)，采集60份疑似PCV感染的組織樣品(包括脾、淋巴結(jié)和肝臟)。取適量組織，經(jīng)研磨后反復(fù)凍融3次，12 000 r/min 離心5 min，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑UNIQ-10柱式病毒基因組DNA抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；SanPrep柱式質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；微柱濃縮DNA凝膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；2×Taq Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)參照GenBank中收錄的PCV2(EU148503、HM038017、KX828234、KX831480)和PCV4(MK986820)全基因序列，用Megalign(DNA Star)進(jìn)行比對(duì)，針對(duì)PCV2Rep基因和PCV4Cap基因高度保守區(qū)域，利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0，分別設(shè)計(jì)1對(duì)特異性檢測(cè)引物P1F/R和P2F/R (表1)，用于擴(kuò)增PCV2(264 bp)和 PCV4 (391 bp)。引物由武漢奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

1.4 單一PCR擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒的構(gòu)建病毒基因組DNA抽提試劑盒提取病毒DNA，利用引物P1F/R和P2F/R分別對(duì)PCV2和PCV4擴(kuò)增。反應(yīng)體系均為25 μL：2×Taq Master Mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、模板2 μL、ddH2O補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min；95℃ 25 s，55℃ 25 s，72℃ 35 s(共35個(gè)循環(huán))；72℃ 10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，用1%凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

表1 雙重PCR引物序列

利用微柱濃縮DNA凝膠回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，并與 pMD18-T連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將鑒定為陽性的菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取重組質(zhì)粒(pMD18-PCV2和pMD18-PCV4)進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank登錄的參考序列進(jìn)行同源性對(duì)比。用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定2種陽性重組質(zhì)粒的濃度，同時(shí)計(jì)算其拷貝數(shù)。

1.5 雙重PCR檢測(cè)方法的建立與條件的優(yōu)化對(duì)雙重PCR檢測(cè)方法的引物濃度比例、退火溫度(53～63℃)、時(shí)間(變性、退火、延伸)進(jìn)行摸索，最后得出最佳反應(yīng)條件。

1.6 雙重PCR特異性試驗(yàn)以PCV2、PCV4、CSFV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV、PRV、E.coli、Salmonellatyphisuis的核酸為模板，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，用1.5建立的雙重PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，以檢測(cè)該雙重PCR方法的特異性。

1.7 雙重PCR的靈敏性試驗(yàn)將質(zhì)粒pMD18-PCV2和pMD18-PCV4等體積混合，將混合的質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋。通過1.5中摸索的最佳條件，以各個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以檢測(cè)本方法的靈敏度。

1.8 雙重PCR方法的重復(fù)性試驗(yàn)對(duì)來自不同地區(qū)的3份PCV2和PCV4混合感染的病料，通過1.5建立的雙重PCR檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增，并且在隨后的2周內(nèi)重復(fù)3次，以檢測(cè)該方法的重復(fù)性。

1.9 臨床樣品檢測(cè)利用雙重PCR檢測(cè)方法，對(duì)采自河南和山西的洛陽、濮陽、焦作、許昌、汶水等10個(gè)地級(jí)市16個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的60份病料進(jìn)行檢測(cè)，并與單一PCR檢測(cè)結(jié)果作比較，評(píng)價(jià)其臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果

2.1 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果利用P1F/R和P2F/R對(duì)PCV2和PCV4陽性病料DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增的片段位置約在264 bp (PCV2)和391 bp (PCV4)處(圖1)，與預(yù)期大小相符。將單一PCR純化產(chǎn)物連接到pMD18-T并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與參考序列之間的同源性為99%以上，表明PCR產(chǎn)物為PCV2和PCV4的目的片段。

2.2 雙重PCR擴(kuò)增條件優(yōu)化及擴(kuò)增結(jié)果通過對(duì)雙重PCR擴(kuò)增條件的摸索，最終確定反應(yīng)體系為25 μL:2×Taq Master Mix 12.5 μL，P1F/R各0.7 μL，P2F/R各0.3 μL，模板2 μL,ddH2O補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min；95℃ 25 s，56℃ 25 s，72℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))；72℃ 10 min。

M.DL1000 DNA Marker；1.PCV2/4雙重PCR產(chǎn)物；2.PCV2產(chǎn)物；3.PCV4產(chǎn)物；4.陰性對(duì)照

2.3 雙重PCR的特異性試驗(yàn)結(jié)果利用已優(yōu)化的雙重PCR方法對(duì)PCV2/4、CSFV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV、PRV、E.coli和Salmonellatyphisuis核酸進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照。結(jié)果顯示，PCV2/4混合模板擴(kuò)增出了2個(gè)條帶(圖2)，大小分別為264(PCV2)和391 bp(PCV4)，而其他病原的核酸及陰性對(duì)照均未出現(xiàn)特異性條帶，表明該方法具有良好的特異性。

M.DL1000 DNA Marker；1.PCV2/4 PCR產(chǎn)物；2～9.CSFV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV、PRV、E.oli、Salmonella typhisuis PCR產(chǎn)物；10.陰性對(duì)照

2.4 雙重PCR的靈敏度試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒的濃度，計(jì)算出PCV2/4的拷貝數(shù)分別為6.11×1010,5.49×1010拷貝/μL。將2種標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒(pMD18-PCV2和pMD18-PCV4)等體積混合，然后進(jìn)行10倍系列稀釋。以10-1～10-10稀釋濃度的混合質(zhì)粒為模板，ddH2O為陰性對(duì)照，進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增。PCV2/4混合質(zhì)粒在10-9稀釋濃度時(shí)能擴(kuò)增出目的條帶，最低檢測(cè)限分別為61.1，54.9 拷貝/μL，表明該方法具有很好的敏感性(圖3)。

M.DL1000 DNA Marker；1～10.PCV2/4混合陽性模板10-1～10-10梯度稀釋后擴(kuò)增結(jié)果；11.陰性對(duì)照

2.5 雙重PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果通過已優(yōu)化的雙重PCR方法對(duì)來自不同地區(qū)的3份PCV2/4混感病料的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照，并在不同的時(shí)間段做3次重復(fù)，每次檢測(cè)結(jié)果都是PCV2/4為陽性，表明本試驗(yàn)所建立的方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床診斷應(yīng)用利用本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法對(duì)從山西和河南省不同地區(qū)采取的60份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示PCV2的檢出率為51.67%(31/60)，PCV4的檢出率為18.33%(11/60)，混合感染檢出率為16.67%(10/57)，雙重PCR檢測(cè)結(jié)果與單一PCR檢測(cè)結(jié)果一致，表明該方法可用于臨床檢測(cè)。

3 討論

目前，PCV2仍然在我國大多數(shù)省份流行，且各個(gè)地區(qū)PCV2陽性檢出率存在一定差異[13-15]。ZHANG等[8]從患有PCV的病料中發(fā)現(xiàn)一種新型的豬圓環(huán)病毒，命名為PCV4，而且本試驗(yàn)從1份患有PMWS的仔豬檢測(cè)出PCV4，而未檢測(cè)到PCV2和PCV3,表明PCV4可能與PCV有關(guān)。PCV4在河南、四川、山西省等多個(gè)省份廣泛存在，而且PCV2和PCV4存在混合感染[8-9]。因此，為了更好地防控PCVAD，臨床上迫切需要建立一種可以同時(shí)檢測(cè)這2種病毒的PCR方法。

田潤(rùn)博等[12]建立檢測(cè)PCV4的單一PCR檢測(cè)方法，而無法檢測(cè)臨床上出現(xiàn)的PCV2和PCV4混合感染。已有研究者分別建立了針對(duì)PCV2和PCV4的熒光定量PCR方法[16-17]，但熒光定量PCR方法成本和操作要求都比較高，很難滿足實(shí)際生產(chǎn)中養(yǎng)豬業(yè)大批量樣品的檢測(cè)。因此，本試驗(yàn)建立了一種快捷、操作簡(jiǎn)單且成本低的雙重PCR方法，為實(shí)際生產(chǎn)中PCV2/4的防控提供技術(shù)支持。

針對(duì)PCV2檢測(cè)引物設(shè)計(jì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)PCV1在Rep基因的65～73 bp處有9個(gè)堿基缺失，而在這段序列附近PCV2各基因型毒株之間相對(duì)保守。因此，將PCV2檢測(cè)引物P1F的3′端設(shè)計(jì)在這個(gè)區(qū)域，既可以確保擴(kuò)增PCV2不同基因型，又可以避免因PCV1引起的非特異性擴(kuò)增。本試驗(yàn)進(jìn)行一系列引物濃度比摸索時(shí)，發(fā)現(xiàn)P2F/R的擴(kuò)增效率高于P1F/R，當(dāng)P1∶P2引物濃度比為7∶3對(duì)擴(kuò)增效果最佳。同時(shí)對(duì)退火溫度、時(shí)間(變性、退火、延伸)進(jìn)行優(yōu)化。通過優(yōu)化后的PCR方法擴(kuò)增出的片段分別在264 (PCV2)和391 bp(PCV4)的位置，相差127 bp，凝膠電泳成像儀中能夠清晰地分辨出兩種病原體。而其他8種常見的病原體檢測(cè)為陰性，并且本試驗(yàn)在不同的時(shí)間段做3次重復(fù)，每次結(jié)果一致，說明本試驗(yàn)所建立的雙重PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。本試驗(yàn)對(duì)3份PCV2/4混合感染樣品在不同的時(shí)間段重復(fù)3次，每次單一PCR方法和雙重PCR方法擴(kuò)增結(jié)果完全一致，說明該方法具有良好的重復(fù)性和準(zhǔn)確性。本試驗(yàn)的靈敏度檢測(cè)結(jié)果顯示PCV2最低檢測(cè)限為61.1拷貝/μL，這與周忠濤等[18]建立的PCV2的PCR檢測(cè)下限相當(dāng)；PCV4最低檢測(cè)限為54.9 拷貝/μL，與田潤(rùn)博等[12]建立的檢測(cè)PCV4的PCR方法檢測(cè)下限相當(dāng)，說明本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法具有良好的靈敏度。

運(yùn)用本試驗(yàn)建立的雙重PCR方法，對(duì)河南洛陽、焦作、濟(jì)源和山西地區(qū)汶水、長(zhǎng)治等10個(gè)地市16個(gè)豬場(chǎng)收集的60份病料樣品進(jìn)行檢測(cè)，PCV2的檢出率為51.67%(31/60)，PCV4的檢出率為18.33%(11/60)，PCV2/4混合感染的檢出率為16.67%(10/60)，雙重PCR結(jié)果與單一PCR結(jié)果完全一致，表明PCV2和PCV4在河南和山西存在單獨(dú)感染和混合感染的情況且比較嚴(yán)重，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)其的檢測(cè)及防控。PCV2是PCVAD的主要致病原，但單獨(dú)感染PCV2很難復(fù)制出PCVAD臨床癥狀[19]。DORRD等[20]報(bào)道大多數(shù)PCVAD由PCV2和其他豬病原共感染引起的，僅少數(shù)PCVAD由 PCV2單獨(dú)感染引起。而且，其他豬病原與PCV2有協(xié)調(diào)作用，能增強(qiáng)PCV2對(duì)所感染組織器官所造成的損傷，還會(huì)提高PCVAD的傳播風(fēng)險(xiǎn)[10-11]。推測(cè)PCV4與 PCV2共感染可能會(huì)引起PCVAD，并且使發(fā)病豬病情加重、病死率增加，給養(yǎng)豬業(yè)帶來更大的危害。

目前PCV4沒有被分離出來，從本試驗(yàn)的臨床檢測(cè)結(jié)果可以看出，PCV4可能是PCV的病原之一，且PCV2/4混合感染已經(jīng)存在于國內(nèi)山西、河南、四川等多個(gè)省份，可能促進(jìn)PCVAD在我國的傳播。本研究建立了一種特異性好、靈敏度高且成本低易操作的雙重PCR方法，可達(dá)到單重PCR檢測(cè)效果的同時(shí)極大地節(jié)約試驗(yàn)成本，更符合臨床上大批量樣品診斷的需求，大大減少檢測(cè)時(shí)的任務(wù)量，為我國臨床上PCV2/4的檢測(cè)和防控提供技術(shù)支持。