PRRSV感染繼發(fā)細(xì)菌性病原的致病性及耐藥性分析

付霞麗，鄭紫方，李 洋，肖書奇，李 爽

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西 楊凌 712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)引起的疾病[1]。其主要病理特征為妊娠母豬的繁殖障礙，表現(xiàn)為流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及仔豬呼吸道疾病[2]。該病毒可引起動(dòng)物機(jī)體免疫抑制，一經(jīng)感染常易繼發(fā)細(xì)菌感染，如鏈球菌、副豬嗜血桿菌[3-4]，每年給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，目前尚無確實(shí)有效手段預(yù)防該疾病的發(fā)生。

綠色氣球菌(Aerococcusviridans)為革蘭陽性菌，屬鏈球菌科、氣球菌屬[5]。該菌在空氣、土壤中廣泛存在，人畜共患，為醫(yī)院常見的條件致病菌，可引起關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、菌血癥、敗血癥[6]。該菌為革蘭陽性球菌，極易與鏈球菌、金黃色葡萄球菌混淆。隨著16S rRNA、基因組測序技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展，越來越多的綠色氣球菌被分離鑒定，逐漸引起人們的重視[7]。本研究從感染PRRSV后發(fā)病最嚴(yán)重豬的胸腔積液中分離出1株細(xì)菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)、16S rRNA序列分析確定該菌為綠色氣球菌，對(duì)其進(jìn)行了藥物敏感性分析，小鼠攻菌試驗(yàn)表明該菌具有致病性。本試驗(yàn)為動(dòng)物疾病的診斷、預(yù)防和治療提供技術(shù)支撐和實(shí)踐指導(dǎo)，同時(shí)對(duì)深入研究綠色氣球菌的致病機(jī)制奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攻毒PRRSV的仔豬胸腔中出現(xiàn)大量積液，無菌采取積液進(jìn)行分離鑒定；5周齡清潔級(jí)BALB/c小鼠購自西安交通大學(xué)。

1.2 試驗(yàn)試劑革蘭染液、氯化鈉、營養(yǎng)瓊脂、酵母提取物、蛋白胨購自上海滬鼎生物科技有限公司；細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自杭州濱和微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自杭州和微生物試劑有限公司；rTaq PCR Master Mix購自北京迪寧生物科技有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)無菌采集病死豬胸腔積液涂布于固體LB平板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h,挑取單個(gè)菌落劃線純化培養(yǎng)。挑取純化后菌落革蘭染色、鏡檢，同時(shí)把單個(gè)菌落接種于液體LB培養(yǎng)基，擴(kuò)大培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 生化試驗(yàn)將接有菌種的液體LB培養(yǎng)基置于37℃恒溫?fù)u床 (160 r/min) 培養(yǎng)24 h后接種于細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h 后觀察結(jié)果。

1.5 藥敏試驗(yàn)參照美國NCCLS藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行:取分離菌純培養(yǎng)物，涂布于普通瓊脂平板上，貼上相應(yīng)藥敏紙片，37℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h觀察結(jié)果，根據(jù)抑菌圈直徑(inhibitory zone diameter，IZD)大小來判定分離菌對(duì)藥物的敏感性。

1.6 生長曲線測定試驗(yàn)取綠色氣球菌斜面菌種1支，以無菌操作挑取1環(huán)菌苔，接入液體LB培養(yǎng)基，靜止培養(yǎng)18 h作種子培養(yǎng)液。取盛有50 mL無菌液體LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶11個(gè)，分別編號(hào)為0.0，1.5，3.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，14.0，16.0，20.0 h。用無菌吸管分別吸取2 mL種子液加入已編號(hào)的11個(gè)三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)。分別按對(duì)應(yīng)時(shí)間取出三角瓶，立即放在冰箱中貯存，待培養(yǎng)結(jié)束同一時(shí)間測定D450值。

1.7 動(dòng)物致病性試驗(yàn)將20只成年小鼠隨機(jī)分為4組：1組為對(duì)照組，2～4組為試驗(yàn)組。2～4組小鼠腹腔注射相同劑量(0.5 mL/只)不同濃度的菌液(1×108，1×107，1×106CFU/mL)，1組腹腔注射無菌生理鹽水0.5 mL/只。試驗(yàn)組和對(duì)照組隔離飼養(yǎng),記錄觀察小鼠的死亡情況。

1.8 16S rRNA鑒定設(shè)計(jì)16S rRNA通用引物，引物序列為：上游引物P1 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物 P2 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，引物由西安擎科生物技術(shù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增16S rRNA條帶的大小為1 500 bp,PCR擴(kuò)增體系為20 μL:rTaq酶10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL,雙蒸水6 μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 50 s，共28個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。目的條帶的PCR產(chǎn)物送至西安擎科生物科技有限公司測序，測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析,并應(yīng)用MEGA 7.1軟件對(duì)16S rRNA基因序列進(jìn)行同源性分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建。

2 結(jié)果

2.1 發(fā)病豬的病變特征豬剖檢前精神極度沉郁，不食，喜臥。剖檢后病理結(jié)果顯示，胸腔有大量淡黃色積液，臟器被覆一層偽膜，脾臟腫大，肝臟有出血性壞死點(diǎn)，淋巴結(jié)腫大，肺黏連，心包表面有纖維素性滲出物覆蓋(圖1)。

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)分離菌株的生長特性和染色結(jié)果顯示，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，在固體LB培養(yǎng)基可見白色、隆起，針尖大小菌落，血平板可見α溶血。革蘭染色鏡檢，該菌為革蘭陽性球菌，呈四聯(lián)或兩聯(lián)(圖2)。

圖1 發(fā)病最嚴(yán)重的豬病理解剖圖

A.分離菌株LB平板生長狀態(tài)；B.分離菌株血平板生長狀態(tài)；C.分離菌株100×油鏡生長狀態(tài)

2.3 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果分離菌株生化鑒定結(jié)果顯示葡萄糖、賴氨酸脫羧酶、麥芽糖、乳糖、蔗糖試驗(yàn)為陽性，阿拉伯糖、尿素、七葉苷、山梨醇、硫化氫試驗(yàn)為陰性(表1)。

2.4 細(xì)菌藥敏試驗(yàn)采用藥敏紙片法檢測分離細(xì)菌對(duì)抗生素的敏感性，結(jié)果顯示分離菌株對(duì)頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢西啶、苯唑西林高度敏感，對(duì)萬古霉素、青霉素G不敏感(表2)。

2.5 細(xì)菌生長曲線測定試驗(yàn)通過測定分離菌株不同時(shí)間的D值，描繪細(xì)菌的生長曲線，結(jié)果如圖3所示，該分離菌在0～4 h為遲緩期、4～6 h為對(duì)數(shù)生長期、6 h以后為平臺(tái)期(圖3)。

2.6 細(xì)菌致病性試驗(yàn)1組小鼠注射0.5 mL無菌生理鹽水，小鼠精神狀態(tài)良好，持續(xù)觀察未見小鼠死亡。2組注射1.0×108CFU/mL菌液小鼠精神極度萎靡，12 h之內(nèi)小鼠全部死亡。3組小鼠注射1.0×107CFU/mL菌液，12 h后小鼠精神萎靡，12 ～24 h小鼠全部死亡。4組小鼠注射1.0×106CFU/mL菌液，24～36 h小鼠死亡3只，36～48 h小鼠死亡2只。剖檢病死小鼠發(fā)現(xiàn)，小鼠肝臟、脾臟有出血點(diǎn)。從死亡小鼠心臟、脾臟、肺臟、肝臟均分離到菌株，經(jīng)革蘭染色鏡檢，菌體形態(tài)與分離菌株一致。16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，片段大小為1 500 bp，符合預(yù)期，膠回收后送測。

表1 細(xì)菌生化反應(yīng)結(jié)果

表2 分離菌株藥物敏感試驗(yàn)

圖3 分離菌株生長曲線

2.7 細(xì)菌16S rRNA基因檢測及序列分析將測定的分離菌株16S rRNA序列與NCBI 中各株綠色氣球菌序列進(jìn)行BLAST對(duì)比分析，結(jié)果同源性均在99%以上。選取10株氣球菌屬的16S rRNA 序列，利用MEGA 7.1 軟件中Neighbor-jioning方法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果如圖5所示，分離菌株SX-YL201903與KU92455.1、KU922464.1、KU922159.1、HQ425688.2同源性最高，表明分離菌株為綠色氣球菌。

表3 分離菌株致病性試驗(yàn) 只

M.DL1000 DNA Marker;1～4.剖檢小鼠16S rRNA擴(kuò)增

3 討論

綠色氣球菌為鏈球菌科氣球菌屬的革蘭陽性球菌，同一種屬的還有尿道氣球菌、柯氣球菌、血?dú)馇蚓⑷四驓馇蚓?，其中綠色氣球菌為典型代表[8]。綠色氣球菌在環(huán)境中廣泛存在，為醫(yī)院常見條件致病菌，常分離于感染的傷口、尿液、關(guān)節(jié)積液等[9-11]。后因?yàn)E用抗生素、養(yǎng)殖過程不規(guī)范等，綠色氣球菌在病死龍蝦、患有乳房炎牛的乳液中被分離鑒定[12-14]，在豬體內(nèi)則鮮有報(bào)道。近些年來，隨著基因測序技術(shù)發(fā)展，以及免疫抑制性疾病的存在，越來越多的綠色氣球菌在豬體內(nèi)被發(fā)現(xiàn)。MARTIN等[15]研究了58 株豬源綠色氣球菌的生物學(xué)特性，提出該菌可能具有致病性。謝彬等[16]先后在廣東和廣西地區(qū)，從發(fā)病仔豬膝關(guān)節(jié)積液中分離到綠色氣球菌。林華等[17]在廣東地區(qū)從患病仔豬的心臟和肺臟中分離到綠色氣球菌。張乃嘉等[18]在安徽省某豬場的發(fā)病仔豬心包積液中分離到綠色氣球菌。LIU等[19]從奶牛體內(nèi)分離到綠色氣球菌，并建立小鼠模型進(jìn)一步研究綠色氣球菌的生物特性。綠色氣球菌在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域逐漸引起人們關(guān)注。

圖5 分離菌株與有關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

氣球菌油鏡下呈四聯(lián)或兩聯(lián)，極易與鏈球菌或葡萄球菌混淆。本試驗(yàn)用16S rRNA通用引物提取細(xì)菌DNA進(jìn)行擴(kuò)增并測序，將測序結(jié)果與NCBI中的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該菌與已知?dú)馇蚓耐葱愿哌_(dá)99%，因此從基因水平確定該菌為綠色氣球菌。除此之外輔助于藥敏試驗(yàn)、生化試驗(yàn)等，進(jìn)一步確定該菌為綠色氣球菌。

本試驗(yàn)從患病豬胸腔積液中分離到綠色氣球菌，與之前報(bào)道的分離部位(關(guān)節(jié)積液、胸腔積液、肺臟、肝臟、脾臟)相符合。動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌有一定的致病力，能使小鼠死亡，說明該菌對(duì)靶動(dòng)物的健康存在威脅。本株菌是在豬感染PRRSV的情況下分離到，且感染綠色氣球菌豬的患病情況比單純感染PRRSV的豬更加嚴(yán)重，說明繼發(fā)綠色氣球菌引起了豬更為嚴(yán)重的病理變化，加快豬死亡。

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該分離菌株對(duì)頭孢他啶、頭孢呋辛、頭孢西啶、苯唑西林高度敏感，對(duì)萬古霉素、青霉素G不敏感，這一結(jié)果與其他地區(qū)分離到的綠色氣球菌的藥敏結(jié)果不完全一致。這是因?yàn)椴煌胤皆陴B(yǎng)殖過程中所使用的抗生素不同，導(dǎo)致豬對(duì)抗生素的敏感性不盡相同，這一結(jié)果為有效治療綠色氣球菌感染提供了可靠的參考依據(jù)。綠色氣球菌為條件致病菌，在動(dòng)物機(jī)體免疫力低下，或飼養(yǎng)條件惡劣的情況下都易導(dǎo)致該菌的侵襲，因此良好的飼養(yǎng)管理對(duì)于該疾病的預(yù)防至關(guān)重要。

本研究從感染PRRSV的豬體內(nèi)分離到致病菌，為繼發(fā)性細(xì)菌感染的研究提供基礎(chǔ)材料，同時(shí)為生產(chǎn)實(shí)踐中該病的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。