5/7型豬細(xì)小病毒雙重PCR檢測方法的建立

王茂鵬，王偉偉，李 笨，李樂天，魯會軍，金寧一，韓 碩，米志強(qiáng)，李 昌*

(1.溫州大學(xué) 病毒學(xué)研究所，浙江 溫州 325035；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 軍事獸醫(yī)研究所 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院人獸共患病毒病防控關(guān)鍵技術(shù)研究創(chuàng)新單元，吉林 長春 130122；3.遼寧省農(nóng)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，遼寧 沈陽 110031；4.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院 微生物流行病研究所，北京100071)

豬細(xì)小病毒(porcine parvoviruses,PPV)為細(xì)小病毒科細(xì)小病毒屬成員，可引起母豬木乃伊胎、不孕不育及死胎等繁殖障礙性疾病，在世界各地的豬群中均有發(fā)現(xiàn)，是造成全球養(yǎng)豬業(yè)經(jīng)濟(jì)損失的重要傳染病之一[1-5]。近年來，已發(fā)現(xiàn)7個基因型PPV(1～7)，通常用于區(qū)分豬細(xì)小病毒亞科成員，而這7個基因型PPV根據(jù)NS1蛋白序列同源性在細(xì)小病毒系統(tǒng)發(fā)育樹上又被劃分為Protoparvovirus、Tetraparvovirus、Chapparvovirus和Copiparvovirus4個不同的屬[5-7]。

PPV5和PPV7分別屬于Copiparvovirus屬和Chapparvovirus屬，于2013和2016年才被相繼發(fā)現(xiàn)。XIAO等[4]對美國不同年齡段豬群感染PPV5進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，其陽性率達(dá)6.6%，略高于PPV4發(fā)病率(4.1%)。除美國外，在中國、波蘭和墨西哥等國家也陸續(xù)檢出PPV5，PPV5常與PPV4及豬圓環(huán)病毒發(fā)生共感染，在肺組織內(nèi)有較高的檢出率，可造成嚴(yán)重的仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰弱綜合征(post-weaning multi-systemic wasting syndrome,PMWS)[3,8-11]。PPV7亞型細(xì)小病毒已經(jīng)在我國東北三省、廣西省、安徽省等多地檢出。現(xiàn)有文獻(xiàn)表明，PPV5和PPV7共感染加重豬只病情[12-14]，但由于這2個亞型發(fā)現(xiàn)時間較短，對共感染病例的檢測尚缺乏有效方法，本研究建立一種針對PPV5/PPV7的雙重PCR檢測方法，并對其進(jìn)行優(yōu)化，以期為深入了解PPV共感染對宿主狀態(tài)的影響儲備關(guān)鍵技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pBM16A載體購自博邁德生物有限公司；LAMP酶、2×Taq DNA Master Mix購自南京諾維贊生物科技有限公司；KOD酶購自日本TOYOBO生物公司；NanoDrop ND-2000C微量核酸檢測儀購自美國Thermo Fisher生物公司；ABI Veriti 96孔梯度PCR儀購自ABI公司。

1.2 引物設(shè)計為了同時滿足PPV5/7的特異性檢測和基因組測序分型，以NCBI數(shù)據(jù)庫中PPV5/7序列NS1基因保守區(qū)域為模板(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi GROUP_TARGET=on)設(shè)計2對引物(表1)，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 雙重PCR引物序列

1.3 擴(kuò)增目的片段按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒使用說明書提取病毒核酸，-80℃保存?zhèn)溆?。以提取的病毒DNA為模板，用表1中相應(yīng)的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收擴(kuò)增產(chǎn)物連接至pBM16A載體，轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，接種LB氨芐抗性液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，提取質(zhì)粒，經(jīng)通用引物和特異性引物鑒定條帶大小正確后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序鑒定。

1.4 核酸模板定量、稀釋與標(biāo)準(zhǔn)品制備以測序正確的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，用Nano-Drop2000C超微量分光光度計測定濃度后，根據(jù)公式[拷貝數(shù)=質(zhì)粒濃度×10-9×6.02×1023/(660×質(zhì)?？傞L度)]將其換算為拷貝數(shù)，10倍倍比稀釋成終濃度為1.0×1013～1.0×101拷貝/μL，作為檢測標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 雙重PCR敏感性試驗分別取稀釋至1.0×101～1.0×108拷貝/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并等體積混合，作為雙重PCR反應(yīng)模板，用優(yōu)化后的反應(yīng)條件進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，以檢測其敏感性。

1.6 雙重PCR反應(yīng)條件優(yōu)化建立10 μL反應(yīng)體系：2×Taq DNA Master Mix 5 μL，2對特異性上、下游引物各0.5 μL，2種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合物1 μL，ddH2O補(bǔ)足10 μL。對雙重PCR引物濃度(終濃度為0.10，0.25，0.50，1.00 μmol/L 4個稀釋度)、循環(huán)數(shù)(25,30，35，40個循環(huán))及酶種類(Taq、LAMP、KOD)等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.7 雙重PCR特異性試驗采用建立的多重PCR方法，分別以重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品等比例混合物和貓細(xì)小病毒(FPV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)DNA或豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，評價該方法特異性。

2 結(jié)果

2.1 PPV5/7檢測引物設(shè)計及系統(tǒng)發(fā)育分析如圖1所示，在PPV5和PPV7的NS1基因分別找到2段高度保守序列，經(jīng)對GC含量和退火溫度優(yōu)化后設(shè)計PPV5(285 F/R)和PPV7(630 F/R)2對引物(圖1A)，其中PPV5(285 F/R)這對引物片段與親緣關(guān)系較近的PPV4相差較大，并且可擴(kuò)增的285 bp 目的片段經(jīng)Mega7構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(the sum of branch length=1.207 367 31，bootstrap=1 000)后能很好的與PPV4和PPV6區(qū)分開，聚類成單獨(dú)的支系(圖1B)。在PPV7(630 F/R)這對引物片段與親緣關(guān)系較近的PPV6區(qū)別較大；同樣的，通過對630 bp片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(the sum of branch length=0.492 286 50，bootstrap=1 000)的構(gòu)建后發(fā)現(xiàn)，該片段能夠與PPV4、PPV5和PPV6區(qū)分開，聚成單獨(dú)的支系，與WANG等[12]、JIN等[15]研究中，根據(jù)NS1基因構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹樹形一致[12,15]，符合預(yù)期設(shè)定。

A.PPV5和PPV7基因組特點(diǎn)及雙重檢測引物設(shè)計示意圖;B.PPV5引物保守性及285 bp目的片段系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建;C.PPV7引物保守性及630 bp目的片段系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

2.2 重組質(zhì)粒制備構(gòu)建與驗證挑選3個單克隆，提取質(zhì)粒，以重組質(zhì)粒pBM16A-PPV5和pBM16A-PPV7為模板利用表1中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，pBM16A載體通用引物M13F/M13R作為陽性對照。結(jié)果顯示，PPV5擴(kuò)增出約為285 bp目的片段，PPV7擴(kuò)增出約為630 bp目的片段，結(jié)果與預(yù)期大小一致(圖2)。pBM16A-PPV5和pBM16A-PPV7測序結(jié)果與對應(yīng)的PPV5和PPV7基因核苷酸序列一致。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.pBM16A-PPV5 PPV5F/R PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;4～6.pBM16A-PPV5陽性對照;7～9.pBM16A-PPV7 PPV7F/R PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;10～12.pBM16A-PPV7陽性對照

2.3 敏感性試驗結(jié)果分別將2個重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品10倍倍比稀釋成終濃度為1.0×1012～1.0×101拷貝/μL，進(jìn)行單一PCR反應(yīng)。再取1.0×101～1.0×108拷貝/μL的2種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品并等體積混合進(jìn)行雙重PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，單一PCR檢測PPV5下限為10拷貝/μL(圖3A)、PPV7下限為10拷貝/μL(圖3B)，雙重PCR檢測這2種重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品下限也為10拷貝/μL(圖4)，表明所建立的雙重PCR敏感性較高。

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～13.101～1012拷貝/μL PPV5(A)或PPV7(B)

M.DL2000 DNA Marker;1.陰性對照;2～9.PPV5和PPV7混合質(zhì)粒101～108 拷貝/μL

2.4 雙重PCR特異性試驗結(jié)果應(yīng)用建立的多重PCR方法，以不同病原DNA或cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，建立的多重PCR方法僅能擴(kuò)增PPV5、PPV7基因組DNA，且與預(yù)期大小相符，而對FPV、PRV、PEDV、TGEV的核酸均無特異性擴(kuò)增(圖5)，表明本研究建立的方法特異性較強(qiáng)。

M.DL2000 DNA Marker;1.PRV;2.TGEV;3.PEDV;4.FPV;5.陽性對照

2.5 雙重PCR方法條件優(yōu)化結(jié)果選擇濃度為1.0×105,1.0×106,1.0×107拷貝/μL的混和模板對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定雙重PCR反應(yīng)的特異性上、下游引物最佳終濃度均為0.5 μmol/L(圖6)。在1.0×103拷貝/μL濃度下對反應(yīng)循環(huán)數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，確定最佳擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為35個(圖7)。選擇1.0×105，1.0×106，1.0×107拷貝/μL對3種品牌的DNA聚合酶(LAMP、Mix、KOD酶)進(jìn)行篩選，根據(jù)條帶梯度、亮度和成本計算，認(rèn)為2×Taq DNA Master Mix為該體系的最適檢測用酶(圖8)。

M.DL2000 DNA Marker;1～3.0.10 μmol/L;4～6.0.25 μmol/L;7～9.0.50 μmol/L;10～12.1.00 μmol/L

2.6 臨床樣品檢測采用建立的多重PCR方法對黑龍江地區(qū)9只疑似患病豬的組織樣品進(jìn)行檢測，其中樣品1，2，5，8為肺組織樣品，3，7為腸組織樣品，4，6，9為脾組織樣品。樣品2，3，6，9和10均檢測到285 bp目的條帶，樣品1，2，4和5檢測出630 bp 目的條帶，表明2，3，6和9號豬都感染PPV5，而1，2，4和5號豬感染PPV7，其中2號豬為PPV5和PPV7混合感染。

M.DL2000 DNA Marker;1～4.循環(huán)數(shù)為25,30,35,40

M1～M3.DL2000 DNA Marker;1～3.LAMP酶;4～6.Taq酶;7～9.KOD酶

M.DL2000 DNA Marker;1～9.對應(yīng)豬臨床樣品;10.陽性對照;11.陰性對照

3 討論

近年來在我國貴州、湖南、廣東、安徽和福建等地區(qū)均有PPV7、PPV5感染的病例[13]。PPV與PRV、豬呼吸與繁殖綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2型和豬瘟病毒相比，其妊娠母豬臨床癥狀不明顯，不容易引起養(yǎng)殖戶的注意，而此類病毒能與其他病原混合感染，嚴(yán)重的可導(dǎo)致豬只死亡或變成僵豬，為臨床診斷帶來困難[16]。目前主要診斷方法有：病毒分離、血凝抑制試驗和乳膠凝集試驗等，其中血凝抑制試驗相對簡便，但由于要制備豚鼠紅細(xì)胞以及被檢血清必須經(jīng)高嶺土或其他方法處理而顯得麻煩；乳膠凝集試驗靈敏度不高，尤其是對隱性感染動物往往漏檢；病毒分離和鑒定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，但是該方法費(fèi)時費(fèi)力，并且需要一定的技術(shù)條件和設(shè)備；PCR及熒光定量PCR診斷具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)已成為診斷PRV的研究熱點(diǎn)[17]。本試驗所建立的PPV5、PPV7雙重PCR，能在1次反應(yīng)中對這2種病原體引起的傳染病進(jìn)行核酸診斷且特異、敏感、快速、簡便，利于防止該病蔓延擴(kuò)散，減少經(jīng)濟(jì)損失，對豬場凈化病原具有潛在的應(yīng)用前景。

PPV病毒粒子無囊膜，直徑約20 nm，基因組為單股DNA，大小4.0～6.3 kb，2個末端序列形成復(fù)雜的回文發(fā)夾結(jié)構(gòu)，全基因組包含2～3個主要的開放閱讀框架，由5′端UTR、非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1)、結(jié)構(gòu)蛋白(Cap)和3′端UTR組成。PPV5的衣殼蛋白(VP1)中存在Ca2+結(jié)合環(huán)(YXGXG)和磷脂酶A2(PLA2)催化中心的HDXXY保守基序，包括D63，據(jù)報道這是PPV進(jìn)入和感染的先決條件[4]。PPV具有高替換率(每年10-3～10-5替換/位點(diǎn))進(jìn)化，且屬內(nèi)的核苷酸替換速率也有不同的特點(diǎn)，PPV7的NS1和Cap蛋白基因的核苷酸突變率高于PPV1～PPV4，揭示PPV的遺傳異質(zhì)性，可能是病毒適應(yīng)各種環(huán)境條件的有效方法[18]。

本研究根據(jù)PPV 2個亞型的保守基因設(shè)計不同長度目的片段的特異性引物，擴(kuò)增到285(PPV5)，630 bp(PPV7)2段目的基因，通過瓊脂糖凝膠電泳直接判定擴(kuò)增結(jié)果，更直觀和實(shí)用，且對以上2片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析時，可以準(zhǔn)確聚集在同一支系上，利于降低結(jié)果假陽性，并開展初步的病毒溯源工作。經(jīng)多個試驗條件優(yōu)化結(jié)果表明，25次循環(huán)時模板濃度較低時無條帶，30～35次循環(huán)時有條帶，條帶清晰穩(wěn)定。使用LAMP酶時目標(biāo)條帶微弱甚至無目標(biāo)條帶，雖然KOD酶擴(kuò)增的條帶清晰但其價格昂貴，綜合這2個因素，使用2×Taq DNA Master Mix最為合適。經(jīng)體系優(yōu)化后，雙重檢測體系檢測下線達(dá)到了單一檢測的靈敏度，為10拷貝/μL，可應(yīng)用豬群的一般檢測工作。此外，本研究設(shè)計的引物可以特異性檢測PPV5/7，不受其他豬源病毒(如PRV、TGEV和PEDV)的干擾，而且也無法檢測到同屬的貓細(xì)小病毒(FPV)。隨機(jī)對2020年期間收集的黑龍江地區(qū)9頭病豬的不同組織樣品檢測發(fā)現(xiàn)，存在1例共感染現(xiàn)象，PPV5和PPV7感染比例44.4%(4/9)。結(jié)果表明，本研究所開發(fā)的檢測方法，具有臨床應(yīng)用價值，可在后續(xù)大群篩查中得以應(yīng)用。