拉曼光譜結(jié)合角度轉(zhuǎn)換快速分析果葡糖漿中果糖

焦天偉，粟暉*，黃金，梁宗杭，黃曉程，姚志湘,2

(1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院 廣西糖資源綠色加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 柳州 545006；2.廣西蔗糖產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧 530004)

果葡糖漿又稱高果糖漿或異構(gòu)糖漿，被廣泛應(yīng)用于甜味劑[1]，其主要成分包括果糖、葡萄糖和少量的低聚糖，其中提高甜度的主要成分是果糖，按果糖占干物質(zhì)的比重不同，一般將果葡糖漿分為F42、F55和F90[2]。目前果葡糖漿中果糖定量分析方法主要有高效液相色譜法[3]、分光光度法[4]和核磁法[5]等。歐少沛等利用高效液相色譜法測(cè)定果葡糖漿中果糖與葡萄糖含量，并采用外標(biāo)法和面積歸一法進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果表明，高效液相色譜配合面積歸一法可以快速、準(zhǔn)確定量果葡糖漿中的果糖及葡萄糖。徐慧詮等采用間苯二酚-分光光度法測(cè)定葡萄糖異構(gòu)糖漿中果糖的含量，結(jié)果表明，異構(gòu)糖漿經(jīng)過(guò)顯色反應(yīng)后在473 nm處的吸光度與果糖含量線性關(guān)系良好，定量準(zhǔn)確性高。Yan等利用核磁共振波譜法定量分析蜜糖漿中的果糖、葡萄糖及蔗糖，結(jié)果表明，采用鄰苯二甲酸氫鉀作為內(nèi)標(biāo)物，可以準(zhǔn)確測(cè)定蜜糖漿中的果糖、葡萄糖及麥芽糖。但是，以上方法普遍存在分析成本高、效率低和前處理復(fù)雜等問題，難以滿足快速分析的要求。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確可以應(yīng)用到果葡糖漿體系的果糖測(cè)定方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

拉曼光譜技術(shù)以其信息豐富、水的影響小、無(wú)需樣品預(yù)處理等獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)，近些年來(lái)在藥物分析[6]、食品[7]和化工[8]等領(lǐng)域得到迅猛發(fā)展。果糖和葡萄糖互為同分異構(gòu)體，拉曼特征波段主要集中在300～1500 cm-1和2700～3400 cm-1。譜圖中波峰重疊和偏移現(xiàn)象嚴(yán)重，難以單純依靠光譜響應(yīng)強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)果糖的定量分析。Ilaxlan等[9]采用拉曼光譜結(jié)合偏最小二乘(partial least squares， PLS)的方法分析了商業(yè)飲料中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量，結(jié)果表明，果糖的拉曼響應(yīng)良好，利用拉曼光譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法定量分析果糖是可行的。但是，PLS較為依賴光譜的特征響應(yīng)，激發(fā)光的穩(wěn)定性、聚焦、固體顆粒的散射、積分時(shí)間的改變和光程差的變動(dòng)等乘性干擾無(wú)法避免。乘性干擾在漫反射近紅外(DRS)、拉曼光譜等光學(xué)儀器測(cè)量時(shí)普遍存在，而且若應(yīng)用于糖液體系，折射率的波動(dòng)會(huì)成倍放大分析誤差，影響分析模型的穩(wěn)定性。Wang等[10]采用DRS測(cè)定肉蓯蓉中果糖、葡萄糖等7種主要成分，分別進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(standard normal variate transformation， SNV)和多元散射校正(multiplicative scatter correction， MSC)消除乘性干擾后，再利用PLS建模，模型的決定系數(shù)均略大于0.94，結(jié)果表明，SNV和MSC處理后的數(shù)據(jù)結(jié)果相似。SNV主要消除散射和光程變化對(duì)漫反射光譜的影響，但是該方法假設(shè)所有變量的標(biāo)準(zhǔn)偏差一致，當(dāng)體系組分性質(zhì)變化較大時(shí)，誤差會(huì)變大。MSC則必須建立“標(biāo)準(zhǔn)光譜”，即含量與強(qiáng)度呈理想線性關(guān)系，建立“標(biāo)準(zhǔn)光譜”的質(zhì)量直接影響誤差校正結(jié)果，但在實(shí)際中，這種“標(biāo)準(zhǔn)光譜”是難以獲取的。綜上，糖液體系折射率波動(dòng)導(dǎo)致放大的乘性干擾問題并沒有得到很好的解決。

姚志湘等[11]發(fā)現(xiàn)若將光譜視為向量，體系總體誤差分布變化則與被關(guān)注向量與其他向量所構(gòu)成的子空間向量夾角有關(guān)，且該向量和其他向量子空間的關(guān)系如果確定，則體系總體誤差呈正態(tài)分布。以此為理論基礎(chǔ)，提出通過(guò)計(jì)算向量空間角消除乘性干擾的方法[12]，并進(jìn)一步提出一種基于子空間角度轉(zhuǎn)換的近似線性定量方法，實(shí)現(xiàn)采用中紅外光譜結(jié)合向量夾角直接定量三氯蔗糖合成過(guò)程的組分含量測(cè)定[13]，并將該方法推廣應(yīng)用于蔗糖-6-乙酸酯的定量分析[14]。該方法的特點(diǎn)是克服乘性干擾；不依賴光譜特征響應(yīng)；光譜特征信息保留度高；高效、便捷、穩(wěn)定性好，為快速準(zhǔn)確的定量分析提供了參考。本文采用子空間角度轉(zhuǎn)換方法和拉曼光譜結(jié)合，建立果葡糖漿中果糖含量的快速分析方法，以間苯二酚-分光光度法作為比對(duì)，并檢測(cè)該方法精密度。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

ExR610拉曼光譜儀 西派特(北京)有限公司；AR124CN電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；S-3100紫外可見分光光度計(jì) 韓國(guó)SCINCO公司。

果糖(生化試劑 BR)：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖(食品級(jí))：廣東光華科技股份有限公司；間苯二酚(分析純)：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；鹽酸(36.0%～38.0%，分析純)：西隴科學(xué)股份有限公司；果葡糖漿：市售。

1.2 子空間角度轉(zhuǎn)換結(jié)合拉曼光譜分析模型建立

1.2.1 建模樣本的配制

取5 mL的F42果葡糖漿(UV，果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29.23%)為基液，按一定配比添加果糖或50%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖溶液，配制一系列果葡糖漿樣本，果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1%～60%的范圍內(nèi)，每?jī)蓚€(gè)樣本間隔3%，共配制21個(gè)樣本，編號(hào)為S1～S21。

1.2.2 樣本拉曼光譜采集

將樣本S1～S21分別置于測(cè)量瓶中，采集拉曼數(shù)據(jù)，每個(gè)樣本采集3次取平均值，采集參數(shù)：積分時(shí)間9 s，平滑點(diǎn)數(shù)0，中心波長(zhǎng)532 nm，功率等級(jí)9，拉曼位移范圍為300～3500 cm-1。

1.2.3 建模步驟

分析模型建立的步驟見圖1。

圖1 分析模型建立流程圖Fig.1 The flow chart of analysis mode

1.3 市售果葡糖漿中果糖含量分析

取F42、F55、F60 3種不同品牌不同批次的果葡糖漿樣品，采集各樣本拉曼光譜。數(shù)據(jù)處理參照1.2.3，分析各樣本中果糖含量，此過(guò)程平行5次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，檢驗(yàn)方法精密度。

1.4 間苯二酚-分光光度法分析果葡糖漿中的果糖含量

參照文獻(xiàn)[4]，配制果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈梯度分布在0.0158‰～0.1183‰之間的8份樣本，采集其可見光譜，建立果糖含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于分析果葡糖漿樣本。

2 結(jié)果與討論

2.1 間苯二酚分光光度法建立果糖含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線

選取各樣本在波長(zhǎng)485 nm處對(duì)應(yīng)的吸光度值，建立果糖含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線。果糖含量在0.0158‰～0.1183‰范圍內(nèi)，線性方程為y=102.56x+0.0795，相關(guān)系數(shù)r=0.9955。

2.2 基于拉曼光譜結(jié)合子空間角度轉(zhuǎn)換的快速分析模型建立

2.2.1 系列樣本拉曼光譜

果葡糖漿、建模樣本、葡萄糖及果糖對(duì)照品的系列樣本拉曼特征峰集中分布在300～1500 cm-1與2500～3500 cm-1兩部分。葡萄糖和果糖在2500～3500 cm-1波段皆有兩個(gè)明顯特征峰，但重疊與覆蓋現(xiàn)象嚴(yán)重，果葡糖漿等兩糖混合樣本易出現(xiàn)波峰偏移問題，所以不考慮將其作特征區(qū)間。300～1500 cm-1波段特征響應(yīng)顯著。取待測(cè)樣本及對(duì)照品譜圖的300～2000 cm-1波段，見圖2。

圖2 F60果葡糖漿、葡萄糖對(duì)照品、果糖對(duì)照品與30%果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的建模樣本的譜圖Fig.2 Raman spectrogram of F60 HFCS, glucose reference sample, fructose reference sample and modeling sample with 30% fructose

2.2.2 果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)與夾角值EE的關(guān)聯(lián)方程建立

建模樣本與參比樣本的選?。喊凑臻g隔4%選取建模樣本，使樣本果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)均勻分布在1%～60%的范圍內(nèi)。選取S1、S2、S4、S5、S7、S8、S10、S11、S13、S14、S16、S17、S19、S20作為建模樣本。參比樣本應(yīng)具有唯一性并且其光譜與背景光譜差異性最大。果糖為測(cè)量組分，背景光譜中不含有果糖特征峰，即果糖含量最大的樣本譜圖與背景光譜差異性最大，樣本S21果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，為60%，且無(wú)相同果糖含量的樣本存在，具有唯一性，故選擇S21為參比樣本。

光譜平滑降噪：樣本中的熒光是導(dǎo)致基線漂移的主要原因。針對(duì)熒光干擾，參照熒光褪色差分法[17](FBDA)校正基線。采用一階濾波求導(dǎo)對(duì)樣本原始光譜進(jìn)行降噪處理。果葡糖漿的拉曼光譜經(jīng)降噪與基線校正處理前后見圖3。

圖3 果葡糖漿基線校正前后的拉曼光譜Fig.3 Raman spectra of HFCS before and after baseline correction

由圖3可知，經(jīng)過(guò)降噪和基線校正處理前的譜圖，噪聲大且基線漂移嚴(yán)重，校正后的譜圖信噪比顯著提高，且能完整的保留原始光譜的形狀。

關(guān)聯(lián)方程建立：分別取二階、一階濾波求導(dǎo)與零階導(dǎo)，移動(dòng)窗口寬度取波段波數(shù)的1/38與1/19，取最大果糖含量樣本S21作為參比樣本，建立移動(dòng)窗口，窗口從最小波數(shù)點(diǎn)向波數(shù)點(diǎn)增大方向移動(dòng)，計(jì)算樣本光譜與參比光譜的夾角值EE，取果糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，夾角值EE為縱坐標(biāo)，采用線性擬合方法，建立相應(yīng)關(guān)聯(lián)方程，見圖4。對(duì)比各方程決定系數(shù)，確定最優(yōu)方案。

圖4 果糖含量與角度值的關(guān)聯(lián)方程Fig.4 The correlation equations between fructose content and angle value

圖4(a)、(b)使用未經(jīng)濾波求導(dǎo)的譜圖計(jì)算所得，相較采用濾波求導(dǎo)的(c)、(d)、(e)、(f)離散程度大，說(shuō)明譜圖經(jīng)過(guò)相應(yīng)濾波降噪可提高EE與果糖含量的線性關(guān)系。經(jīng)二階濾波求導(dǎo)降噪后，計(jì)算得方程(e)、(f)，一階濾波得(c)、(d)。經(jīng)計(jì)算得到各方程相關(guān)系數(shù)(R)。方程(c)、(d)相關(guān)系數(shù)R均大于0.99，擇優(yōu)錄取，選擇方程(c)建立果糖含量分析方法。

2.2.3 方法驗(yàn)證

取S3、S6、S9、S12、S15、S18樣本，依照2.2.2步驟計(jì)算得到EE值，代入建立的關(guān)聯(lián)方程，預(yù)測(cè)值與誤差分析結(jié)果見表1。絕對(duì)誤差在0.07%～2.46%之間，相對(duì)誤差在0.20%～5.98%之間，結(jié)果表明，模型精度高，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確。

表1 驗(yàn)證集樣本的EE值與誤差分析結(jié)果Table 1 The EE values and error analysis results of validation set samples

2.3 市售果葡糖漿果糖含量分析

同2.2取S21為參比樣本，計(jì)算得到果葡糖漿樣品與參比樣本的夾角值EE，代入2.2.2建立的關(guān)聯(lián)方程中，計(jì)算得到各樣本中果糖含量，并與間苯二酚-分光光度法測(cè)定值作比對(duì)，結(jié)果見表2。

表2 市售果葡糖漿果糖含量預(yù)測(cè)值與誤差分析結(jié)果Table 2 The predictive values and error analysis results of fructose content in commercial HFCS

由表2可知，拉曼光譜結(jié)合子空間角度轉(zhuǎn)換方法預(yù)測(cè)值與間苯二酚-分光光度法預(yù)測(cè)值絕對(duì)誤差在0.64%～2.31%之間，相對(duì)誤差在1.89%～6.77%之間。平行分析各市售果葡糖漿5次，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)，結(jié)果見表3。

表3 精密度分析結(jié)果Table 3 The precision analysis results

由表3可知，各樣本的RSD在0.34%～2.32%，說(shuō)明所建立的拉曼光譜結(jié)合子空間角度轉(zhuǎn)換的方法精密度高、準(zhǔn)確性好，適用于無(wú)損、快速分析果葡糖漿中果糖含量。

3 結(jié)論

本文采用拉曼光譜采集樣品信息，以子空間角度轉(zhuǎn)換的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法消除乘性干擾，建立了市售果葡糖漿的拉曼光譜快速分析方法。果糖含量-夾角值關(guān)聯(lián)模型相關(guān)系數(shù)R為0.9991，相對(duì)誤差在1.89%～6.77%之間，對(duì)市售果葡糖漿的分析相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.34%～2.32%。本方法分析效率高、操作簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性好，可用于果葡糖漿生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)品的品質(zhì)監(jiān)控和商品的市場(chǎng)監(jiān)督。